实验海洋生物学重点实验室知识库

   牙鲆（Paralichthys olivaceus）和大菱鲆（Scophthalmus maximus）是我国养殖鲆鱼的重要代表，在东部沿海地区已形成了大规模养殖模式。在牙鲆和大菱鲆养殖过程中，病害问题日益频发，造成了严重的经济损失。传统的抗生素和化学药物治疗虽然取得了一定效果，但也造成水环境污染，还有可能带来食品安全问题。深入了解养殖鲆类的免疫机制，将促进绿色病害免疫防控技术的研发。在本论文中，我们研究了鲆鱼重要免疫因子——炎性白细胞介素，包括牙鲆白细胞介素（Interleukin，IL）21（命名为PoIL-21）和34（命名为PoIL-34）以及大菱鲆IL-20（命名为SmIL-20）和IL-18，分析了它们在不同条件下的表达模式，以及在调节免疫和感染过程中发挥的作用，以期揭示鲆类的抗感染免疫机制，从而为安全高效的病害免疫防治奠定基础。

       IL-21是一种多效性的细胞因子，在先天性免疫和获得性免疫中发挥着重要功能。在哺乳动物中，IL-21与受体结合可以激活JAK/STAT信号通路，调节多种细胞的增殖和活化。在本论文研究中，我们发现PoIL-21由142个氨基酸组成，有4个α螺旋和4个保守的半胱氨酸残基，与其他硬骨鱼的IL-21有25.17-46.25%的序列相似性。PoIL-21在多个组织中呈组成型表达，在肠道的表达水平最高。在肝脏、脾脏和肾脏中，PoIL-21的表达以时间依赖的方式受到迟缓爱德华氏菌感染的调节。PoIL-21是具有信号肽的分泌蛋白，在LPS（lipopolysaccharide）的刺激下可由外周血白细胞（peripheral blood leukocyte，PBL）分泌。重组PoIL-21（rPoIL-21）可以与多种细菌结合，并能显著抑制海豚链球菌的生长。rPoIL-21能与PBL结合，激活PoIL-21受体（PoIL-21R）的表达和特定的STAT通路，上调T细胞相关基因（CD8和T-bet）和炎症细胞因子（TNF-α和IL-1β）的表达水平，促进细胞的增殖和ROS（reactive oxygen species）产生，显著增强PBL抗细菌感染的能力。同样，rPoIL-21在牙鲆体内也可以上调T细胞相关基因和炎症细胞因子的表达水平。综上所述，这些结果表明PoIL-21是一种可以被细菌诱导的促炎细胞因子，具有广泛的细菌结合能力，在活化免疫细胞、调节宿主抗细菌免疫方面发挥着重要作用。

       IL-34是2008年新发现的一种细胞因子，对包括免疫反应在内的多种细胞活动有重要影响。在哺乳动物中，IL-34可以调节多种细胞（单核细胞、巨噬细胞等）的增殖、分化、迁移和存活，参与病毒、细菌等感染引起的免疫反应。在鱼类中，关于IL-34功能的研究很少。在本论文中，我们研究了PoIL-34在炎症发生和免疫防御方面的功能。PoIL-34由215个氨基酸组成，有4个保守半胱氨酸残基用于形成二硫键，具有IL-34超家族的保守结构。PoIL-34与人和小鼠IL-34分别有22.54%和21.52%的序列相似性，与其他硬骨鱼IL-34的序列相似性相对更高。PoIL-34的表达在牙鲆的多种组织中被检测到，其中在肠道和心脏中的表达水平较高。迟缓爱德华氏菌感染能引起PoIL-34在免疫器官（肝脏、脾脏和头肾）中的表达上调。非变性凝胶电泳表明重组PoIL-34（rPoIL-34）以同源二聚体的形式存在。体外实验表明，rPoIL-34可以与PBL结合，激活JAK/STAT信号通路，上调炎症细胞因子（TNF-α和IL-1β）的表达水平，促进ROS和酸性磷酸酶的产生，增强细胞对细菌感染的抵抗力。体内实验表明，rPoIL-34对牙鲆个体也产生类似的刺激作用。当在牙鲆体内过表达PoIL-34时，促炎因子的表达明显增强，抑炎因子的表达受到抑制，牙鲆清除入侵细菌的能力得到增强。这些结果表明，PoIL-34可能通过诱导炎症发生和调节免疫应答，对牙鲆抗细菌感染的免疫防御有重要影响。

       IL-20是IL-10细胞因子家族的成员，在调节炎症和宿主免疫防御方面发挥重要作用。在本论文研究中，我们克隆了大菱鲆IL-20（SmIL-20）并研究了其生物学功能。序列分析结果显示，SmIL-20由195个氨基酸组成，包含1个N端信号肽序列和6个保守的半胱氨酸残基，与其他硬骨鱼类的IL-20具有35.68-46.27%的序列相似性。SmIL-20在多个组织中呈组成型表达，在血液中检测到最高水平表达。SmIL-20受迟缓爱德华氏菌感染后下调表达，但在哈维氏弧菌感染后上调表达。重组SmIL-20（rSmIL-20）通过结合细菌细胞壁成分（脂多糖、肽聚糖和葡聚糖）与多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌结合。rSmIL-20能够抑制迟缓爱德华氏菌对宿主细胞的粘附和侵染。与PBL结合后，rSmIL-20能促进ROS的产生，上调免疫基因TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的表达水平，但对IL-8的表达没有影响。体内实验结果显示，rSmIL-20可以上调肝脏、脾脏和头肾中IFN-γ的表达水平。这些结果表明，SmIL-20在诱导炎症和增强免疫方面发挥重要调节作用。

       IL-18是一种能影响多种细胞活动、调节炎症反应和免疫防御的多效细胞因子。在哺乳动物中，IL-18以非活性前体（pro-IL-18）的形式合成，并主要通过Caspase-1加工成成熟的IL-18。在鱼类中，关于IL-18的报道有限。在本工作中，我们发现了大菱鲆的两个IL-18，命名为IL-18a和IL-18b，分别由196和186个氨基酸组成，IL-18b仅在N端比IL-18a少了十个氨基酸的片段。IL-18a和IL-18b在大菱鲆的各种组织中均被检测到，并以时间依赖的方式受哈维氏弧菌感染而上调。哈维氏弧菌感染腹腔巨噬细胞能引起pro-IL-18发生剪切。重组IL-18a（rIL-18a）能被重组大菱鲆caspase 6/8（rSmCASP6/8）剪切，生成成熟的IL-18（mIL-18），而重组IL-18b（rIL-18b）则不被rSmCASP6/8剪切。体外研究表明，重组的成熟IL-18a（rmIL-18a）比rIL-18a/b有更高的生物学活性，能上调PBL中IFN-γ、TNF-α和IL-1β的表达水平。这些结果表明，IL-18参与细菌感染后的免疫应答，并调节宿主细胞的免疫功能。

       综上，我们通过对牙鲆和大菱鲆四个炎性白细胞介素的研究，明确了它们在活化细胞、调节炎症和抗细菌感染免疫中的作用，研究结果加深了我们对鱼类炎性白细胞介素免疫功能的理解，为水产病害的免疫防控提供了理论基础。

第 1 章 绪论............................................................................................................1
1.1 硬骨鱼类免疫系统...........................................................................................1
1.1.1 硬骨鱼类免疫系统概述............................................................................1
1.1.2 硬骨鱼类先天性免疫系统........................................................................3
1.1.3 白细胞介素的种类....................................................................................5
1.2 白细胞介素 21................................................................................................10
1.2.1 白细胞介素 21 概述................................................................................10
1.2.2 白细胞介素 21 的受体及信号通路........................................................10
1.2.3 白细胞介素 21 的生物学功能................................................................12
1.2.4 白细胞介素 21 在硬骨鱼中的研究现状................................................14
1.3 白细胞介素 34................................................................................................15
1.3.1 白细胞介素 34 概述................................................................................15
1.3.2 白细胞介素 34 的受体及信号通路........................................................16
1.3.3 白细胞介素 34 的表达调控....................................................................18
1.3.4 白细胞介素 34 的功能............................................................................19
1.3.5 白细胞介素 34 在硬骨鱼中的研究现状................................................23
1.4 白细胞介素 20................................................................................................24
1.4.1 白细胞介素 20 概述................................................................................24
1.4.2 白细胞介素 20 的受体及信号通路........................................................24
1.4.3 白细胞介素 20 的生物学功能................................................................25
1.4.4 白细胞介素 20 在硬骨鱼中的研究进展................................................26
1.5 白细胞介素 18................................................................................................27
1.5.1 白细胞介素 18 概述................................................................................27
1.5.2 白细胞介素 18 的受体及信号通路........................................................28
1.5.3 白细胞介素 18 的生物学功能................................................................29
1.5.4 白细胞介素 18 在硬骨鱼中的研究进展................................................30
1.6 本论文的研究目的和意义.............................................................................31
第 2 章 牙鲆 IL-21 的免疫功能研究............................................................33
牙鲆和大菱鲆四个炎性白细胞介素的免疫功能研究
IX
2.1 材料和方法.....................................................................................................33
2.1.1 实验材料..................................................................................................33
2.1.2 实验方法..................................................................................................36
2.2 实验结果.........................................................................................................51
2.2.1 PoIL-21 序列分析 ...................................................................................51
2.2.2 PoIL-21 表达模式分析 ...........................................................................52
2.2.3 PoIL-21 分泌至胞外分析 .......................................................................54
2.2.4 rPoIL-21 结合并影响细菌生长..............................................................55
2.2.5 rPoIL-21 对 PBL 的影响.........................................................................57
2.2.6 rPoIL-21 对细菌侵染的影响..................................................................61
2.2.7 体内实验分析 rPoIL-21 对免疫基因的表达调控.................................62
2.3 讨论.................................................................................................................63
第 3 章 牙鲆 IL-34 的免疫功能研究............................................................67
3.1 材料和方法.....................................................................................................67
3.1.1 实验材料..................................................................................................67
3.1.2 实验方法..................................................................................................67
3.2 实验结果.........................................................................................................73
3.2.1 PoIL-34 序列分析 ...................................................................................73
3.2.2 PoIL-34 表达模式分析 ...........................................................................74
3.2.3 PoIL-34 存在形式分析 ...........................................................................76
3.2.4 rPoIL-34 与 PBL 结合.............................................................................77
3.2.5 rPoIL-34 对 PBL 活化以及抗菌影响.....................................................77
3.2.6 体内实验分析 rPoIL-34 对炎症相关基因的表达调控.........................80
3.2.7 体内过表达 PoIL-34 对炎症和细菌侵染的影响 ..................................81
3.3 讨论.................................................................................................................83
第 4 章 大菱鲆 IL-20 的免疫功能研究.......................................................87
4.1 材料和方法.....................................................................................................87
4.1.1 实验材料..................................................................................................87
4.1.2 实验方法..................................................................................................87
4.2 实验结果.........................................................................................................90
4.2.1 SmIL-20 序列分析..................................................................................90
目 录
X
4.2.2 SmIL-20 在正常生理条件下的表达模式分析......................................92
4.2.3 SmIL-20 在病原菌感染下的表达模式分析..........................................93
4.2.4 rSmIL-20 的表达纯化.............................................................................94
4.2.5 rSmIL-20 结合细菌.................................................................................95
4.2.6 rSmIL-20 结合细菌细胞壁成分.............................................................97
4.2.7 rSmIL-20 结合并活化 PBL ....................................................................98
4.2.8 rSmIL-20 对 PBL 抗细菌感染能力的影响 .........................................100
4.2.9 rSmIL-20 对大菱鲆 IFN-γ 的表达调控 ...............................................101
4.3 讨论...............................................................................................................102
第 5 章 大菱鲆 IL-18 的免疫功能研究.....................................................105
5.1 材料和方法...................................................................................................105
5.1.1 实验材料................................................................................................105
5.1.2 实验方法................................................................................................105
5.2 实验结果.......................................................................................................108
5.2.1 IL-18 序列分析 .....................................................................................108
5.2.2 IL-18 在正常生理条件下的表达模式分析 .........................................110
5.2.3 IL-18 在病原菌感染下的表达模式分析 .............................................111
5.2.4 rIL-18 和 rSmCASP6/8 的表达纯化 ....................................................112
5.2.5 rSmCASP6/8 的剪切特异性检测.........................................................113
5.2.6 Caspase 对 rIL-18 的剪切分析.............................................................114
5.2.7 细菌感染对 pro-IL-18 的剪切分析......................................................116
5.2.8 rIL-18 对 PBL 免疫基因的表达调控...................................................116
5.3 讨论...............................................................................................................117
结 论......................................................................................................................121
参考文献.................................................................................................................123
附录一 实验所用溶液的配制方法..............................................................151
附录二 本实验所用的引物序列..................................................................158
致 谢......................................................................................................................163
攻读学位期间发表的学术论文与科研成果................................................165