实验海洋生物学重点实验室知识库

我国海域辽阔，海洋生物资源丰富，海洋生物体内蕴含了许多结构独特的活性化合物，具有极大的药物开发和应用潜力，这也使越来越多的国内外学者将注意力转向了海洋活性化合物的发掘。本论文对来自黄渤海的黄海胆(Glyptocidaris crenularis)、虾夷马粪海胆(Strongylocentrotus intermedius)和大连紫海胆(Strongylocentrotus nudus)的生殖腺多糖，以及西太平洋深海细菌胞外多糖进行了分离纯化和理化性质分析；对多糖的免疫调节活性和抗病毒活性进行了筛选，探讨了多糖生物活性的作用机制，并且对活性多糖进行了结构表征。以期发掘具有开发价值的海洋活性多糖，并为阐明海胆多糖和深海细菌多糖的构效关系提供一定的理论基础。主要研究结果如下：

(1) 采用水提法和碱提法依次对海胆生殖腺多糖进行了提取。大连紫海胆、黄海胆和虾夷马粪海胆多糖的水提得率分别为11.1%、9.4%和24.9%，碱提得率分别为6.2%、2.7%和3.9%。采用蛋白酶联合酶解和DEAE Fast Flow阴离子交换柱分离后得到24种组分，采用Sephadex G系列凝胶过滤柱分离纯化后得到5种纯化多糖(ZS-1B、MS-1B、HS-1B、MSGA和HJ2A)。对各级纯化多糖组分(共35种)进行理化性质测定，其中，总糖含量较高的组分有ZS-1 (78.90%)、HS-1 (76.50%)、HJ-1 (53.40%)、HJ-2 (49.60%)和MS-1 (66.00%)等；ZS-1B、HS-1B、MS-1B、HJ-2A和MSG-A的蛋白质含量分比为8.60%、7.00%、13.20%、0.10%和0.30%；各组分基本不含硫酸基。各多糖组分间的相对分子量差异较大(4 kDa~600 kD)，其中，ZS-1B、HS-1B和MS-1B的分子量约为4 kDa，MSGA和HJ2A的分子量分别为2.65×10⁴ kDa和8.06×10³ kDa。海胆多糖单糖组成主要以Man、GlcN和Glc为主，部分组分还含有少量的Rha、GlcA、GalN、Gal和Fuc。其中，ZS-1B、MS-1B和HS-1B由Man、GlcN和Glc组成，摩尔比分别为5.18: 1.00: 4.13、7.78: 1.91: 1.00和5.06: 1.00: 8.01，MSGA和HJ2A由Glc组成。体外活性筛选表明MSGA和HJ2A具有潜在的免疫增强活性。

(2) 对来自中国南海冷泉区域的98株细菌菌株，及一株来自雅浦海沟的芽孢杆菌Bacillus sp. BS11进行了发酵和胞外多糖的提取，共制备了70余种胞外多糖。体外活性筛选表明，盐单胞菌Halomonas sp. 2E1和Halomonas sp. 2C11胞外多糖(EPS2E1和EPS2C11)具有潜在的免疫增强活性，芽孢杆菌Bacillus sp. BS11胞外多糖(EPS11)具有显著的免疫抑制活性。采用离子交换柱和凝胶柱层析对EPS11、EPS2E1进行了分离纯化和理化性质分析。EPS11和EPS2E1的总糖含量分别为49.5%和83.1%；蛋白质含量分别为30.2%和7.9%；EPS11的相对分子质量为306.0 kDa，EPS2E1的分子量为47.0 kDa；EPS11的单糖包括Man、GlcN、GalN、Glc、Gal、Rha和GlcA，摩尔比为13.08: 7.84: 8.23: 4.73: 7.03: 1.00: 1.03；EPS2E1只含有Man和Glc，摩尔比为3.76: 1；EPS11为糖蛋白，含有20种氨基酸，总氨基酸含量为30.5%，其中主要有Glu、Asp、Ser和Gly；EPS11中的蛋白质与8个已知蛋白具有同源性，主要蛋白为碱性杆菌蛋白酶F (Bacillopeptidase F)和肌动蛋白(Actin)。

(3) 采用红外光谱、甲基化、核磁共振波谱和质谱等技术方法，对活性多糖MSGA、HJ2A、EPS2E1、ZS-1B、MS-1B和HS-1B进行了结构表征。MSGA和HJ2A为海胆中的糖原成分，存在三种连接方式，分别为Glc-(1→，→4)-Glc-(1→，和→4, 6)-Glc-(1→，摩尔比分别为1.01: 2.75: 1.00和2.19: 3.18: 1.00。MSGA和HJ2A具有高分支度的结构，两者平均每5个残基存在一个分支；EPS2E1是一种高度分支的杂多糖，主链主要包含→2)-Man-(α-1→和→2, 6)-Man-(α-1→，摩尔比为2.45: 1.00，还包含其它位置未确定残基→4)-Glc-(α-1→、→6)-Man-(α-1→和→3)-Glc-(β-1→。HS-1B、MS-1B和ZS-1B的连接方式多样，结构复杂但有相似之处。它们均含有(1→2)、(1→4)、(1→6)、(1→3, 6)和(1→4, 6)糖苷键。其中，HS-1B中以(1→4)连接为主，MS-1B以(1→2)连接为主，而ZS-1B中(1→2)、(1→4)、(1→6)和(1→4, 6)连接的比例相当，均在主链残基的3、4或6位有分支。另外，HS-1B中有少量的(1→3)连接。

(4) 以RAW264.7巨噬细胞为体外模型，对2种海胆糖原和3种细菌胞外多糖进行了免疫调节活性的研究。海胆糖原(MSGA和HJ2A)在0~800 μg/mL浓度范围内无细胞毒性，胞外多糖EPS2E1和EPS2C11在0~200 μg/mL浓度范围内无细胞毒性；它们均具有炎症刺激作用，通过促进NF-κB信号通路中IκB和P65，以及MAPKs通路中ERK1/2、JNK或P38等蛋白的磷酸化而上调炎症相关基因的表达，诱导RAW264.7巨噬细胞分化为M1型，显著促进炎性细胞介质和关键酶(NO、COX-2、IL-1、IL-6和TNF-α)的产生。胞外多糖EPS11在0~200 μg/mL浓度范围内通过抑制MAPKs和NF-κB信号通路中P38、ERK1/2、JNK、IκB和P65蛋白的磷酸化，或可能通过促进NF-κB的泛素化，抑制炎症相关基因的表达，减少炎症信号在细胞内的转导，显著抑制由脂多糖(LPS)诱导分化为M1型的巨噬细胞产生NO、COX-2、IL-1、IL-6和TNF-α，且无细胞毒性。

(5) 通过表面等离子体共振(SPR)技术和假病毒模型探究了海胆多糖(MS-1B、HS-1B、ZS-1B、MSGA和HJ2A)抗SARS-CoV-2病毒的活性。SPR结果表明，海胆多糖MS-1B、HS-1B、ZS-1B、MSGA和HJ2A均对S-蛋白有较强的亲和力，并且以剂量依赖方式相互作用；采用假病毒模型，说明了MSGA、HJ2A、HS-1B和ZS-1B能竞争性抑制S-蛋白与ACE2结合，阻止SARS-CoV-2病毒进入细胞，这可能是海胆多糖抗病毒活性的机制之一，而MS-1B与S-蛋白无明显结合能力。

目前对海胆以及深海细菌的研究主要集中在代谢、进化和发育等方面，近年来虽然有学者对多糖越来越关注，但对其精细结构的解析仍存在较大困难，并且对生物活性机制的研究还不够深入。本论文的研究为活性海洋多糖的开发利用，以及阐明海胆多糖和深海细菌多糖的构效关系提供了一定的理论基础。

第一章 引言... 1

1.1 海洋活性物质及药物的研究现状... 1

1.2 海洋多糖的研究概述... 3

1.2.1 海洋多糖的类型和结构... 3

1.2.2 海洋多糖的生物活性... 5

1.2.3 海洋多糖的提取分离和纯化... 8

1.2.4 多糖的结构表征... 13

1.3 海胆的研究进展... 16

1.4 海洋微生物的研究进展... 18

1.5 研究的目的意义和主要内容... 21

第二章 海胆生殖腺多糖的提取、分离纯化和活性筛选... 23

2.1 引言... 23

2.2 实验材料和仪器... 23

2.2.1 实验原料... 23

2.2.2 实验试剂... 23

2.2.3 实验仪器... 24

2.3 实验方法... 25

2.3.1 海胆前处理... 25

2.3.2 海胆多糖的提取... 25

2.3.3 海胆多糖的分离纯化... 25

2.3.4 海胆多糖的理化性质分析... 27

2.3.5 海胆活性多糖的筛选... 29

2.4 实验结果... 30

2.4.1 海胆前处理... 30

2.4.2 海胆多糖的提取... 30

2.4.3 海胆生殖腺多糖的分离纯化... 31

2.4.4 海胆多糖的理化性质分析结果... 34

2.4.5 海胆活性多糖的筛选结果... 43

2.5 本章小结... 44

第三章 海洋微生物胞外多糖的分离纯化和活性菌株的筛选... 45

3.1 引言... 45

3.2 实验材料和仪器... 45

3.2.1 实验原料... 45

3.2.2 实验试剂... 46

3.2.3 实验仪器... 46

3.3 实验方法... 47

3.3.1 菌株培养及鉴定... 47

3.3.2 胞外多糖的提取... 48

3.3 3 活性胞外多糖的筛选... 48

3.3.4 活性胞外多糖EPS11和EPS2E1的分离纯化... 49

3.3.5 胞外多糖的理化性质分析... 50

3.4 实验结果... 50

3.4.1 胞外多糖的提取和免疫调节活性筛选... 50

3.4.2 胞外多糖的分离纯化... 52

3.4.3 胞外多糖的理化性质分析结果... 54

3.5 本章小结... 60

第四章 活性多糖的结构表征... 63

4.1 引言... 63

4.2 实验材料和仪器... 63

4.2.1 实验材料... 63

4.2.2 实验仪器... 63

4.3 实验方法... 64

4.3.1 红外光谱分析(FT-IR) 64

4.3.2 甲基化分析... 64

4.3.3 部分酸降解... 65

4.3.4 电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析... 65

4.3.5 核磁共振波谱(NMR)分析... 66

4.5 实验结果... 66

4.5.1 海胆多糖MSGA的结构表征... 66

4.5.2 海胆多糖HJ2A的结构表征... 75

4.5.3 胞外多糖EPS2E1的结构表征... 81

4.5.4 海胆多糖HS-1B的结构表征... 88

4.5.5 海胆多糖MS-1B的结构表征... 94

4.5.6 海胆多糖ZS-1B的结构表征... 99

4.6 本章小结... 104

第五章 海胆多糖和微生物胞外多糖的免疫调节活性研究... 105

5.1 引言... 105

5.2 实验材料和试剂... 106

5.2.1 实验原料... 106

5.2.2 实验试剂... 106

5.2.3 实验仪器... 107

5.3 实验方法... 107

5.3.1 RAW264.7巨噬细胞的培养... 107

5.3.2 多糖体外对RAW264.7细胞活力的影响... 107

5.3.3 多糖体外对RAW264.7巨噬细胞一氧化氮(NO)生成的影响... 108

5.3.4 内毒素检测实验... 108

5.3.5 酶联免疫吸附(ELISA)实验... 108

5.3.6 蛋白质免疫印迹(Western blot)实验... 109

5.4 实验结果... 110

5.4.1 MSGA的免疫增强活性... 110

5.4.2 EPS11的免疫抑制活性... 114

5.4.3 EPS2E1的免疫增强活性... 119

5.4.4 EPS2C11的免疫增强活性... 124

5.4.5 HJ2A的免疫增强活性... 126

5.5 讨论... 129

5.6 本章小结... 131

第六章 海胆多糖的抗SARS-CoV-2病毒活性研究... 133

6.1 引言... 133

6.2 实验材料和试剂... 133

6.2.1 实验原料... 133

6.2.2 实验试剂... 134

6.2.3 实验仪器... 134

6.3 实验方法... 134

6.3.1 SPR检测多糖与SARS-CoV-2 Spike蛋白的相互作用... 134

6.3.2 海胆多糖对假病毒感染HEK293细胞的影响... 135

6.4 实验结果... 135

6.4.1 SPR检测多糖与SARS-CoV-2 Spike蛋白的相互作用结果... 135

6.4.1 海胆多糖对假病毒感染HEK293细胞的影响... 137

6.5 讨论... 139

6.6 本章小结... 139

第七章 结论与展望... 141

7.1 结论... 141

7.2 创新点... 142

7.3 展望... 142

参考文献... 145

致 谢... 161

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 163