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栉孔扇贝G-型溶菌酶基因多态性标记筛选及其辅助育种方法 专利
专利类型: 发明, 专利号: CN200810015048.4, 申请日期: 2008-09-03, 公开日期: 2008-09-03
发明人:  宋林生;  李凌;  赵建民
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2)抗病群体和敏感群体的制备  1、一种栉孔扇贝抗病相关g-型溶菌酶基因标记  3)抗病相关g-型溶菌酶基因标记的筛选  其特征在于它的技术内容包括以下四个方面：1)栉孔扇贝g-型溶菌酶基因启动区部分序列的克隆  4)携带抗病相关基因标记个体的快速筛查。1)栉孔扇贝g-型溶菌酶基因启动区部分序列的克隆：参照分子克隆所述方法从栉孔扇贝闭壳肌中提取总dna  根据已知的g-型溶菌酶基因序列在其启动子区设计引物  克隆得到一段762个碱基的dna序列  即从不同海区和养殖场收集栉孔扇贝个体  连入t载体后进行测序  用病原菌浸泡感染  Pcr扩增42个敏感个体和40个抗病个体的g-型溶菌酶启动区序列后  其中-754id和-754ii个体在抗病群体和敏感群体中出现的频率无显著差别  获得其核苷酸序列。2)抗病群体和敏感群体的制备：采用人工感染的方法获得抗病群体和敏感群体  根据死亡时间判断扇贝对病原菌感染抵抗能力  针对-754tatctcgatcagg插入/缺失(I/d)及-391a/g转换分别选用taq I和hap Ii对pcr产物进行酶切  而-391aa个体在敏感群体中出现的频率显著高于抗病群体  将扇贝分为抗病群体和敏感群体。3)抗病相关g-型溶菌酶基因标记的筛选：对来自5个个体的10个克隆进行了测序  聚丙烯酰胺凝胶电泳后  -391ag个体在抗病群体中出现的频率显著高于敏感群体。因此  发现了10处多态性位点  各发现两种基因型  将-391aa作为疾病敏感相关的g-型溶菌酶基因标记  -754ii  而将-391ag作为抗病相关的g-型溶菌酶基因标记。4)携带抗病相关基因标记个体的快速筛查：取栉孔扇贝个体全血1μl作为模版  -754id  Pcr扩增g-型溶菌酶基因启动区序列  -391aa和-391ag  用hap Ii对产物进行酶切  聚丙烯酰胺凝胶电泳分型后  选择-391ag个体作为抗病个体。