中国科学院海洋研究所机构知识库

种质退化、环境适应性差等问题已成为制约我国大型海藻产业可持续发展的关键因素。在产业转型升级及极端环境多发等环境压力背景下，环境适应性强、品质优、生长快等经济性状明显的新种质培育显得尤为重要。然而，常规的选育、杂交、诱变育种等方法存在时间长、效率低等缺点。因此，研究开发先进的分子育种技术，提升新品种培育效率是当务之急。条斑紫菜的遗传背景清晰，且具备独特的生活史及完善的遗传转化体系。这使得其成为基于靶向分子育种技术进行种质创制的理想研究对象。本论文以条斑紫菜为对象，探索构建适用于其功能基因编辑研究的底盘藻株及核酸酶与sgRNA分步导入的新型基因编辑策略。此外，基于PyM-LP2的过表达，我们获得抗氧化胁迫能力显著提升的条斑紫菜种质资源。主要研究内容如下：

（1）CRISPR/Cas基因编辑体系构建：

一方面，为构建条斑紫菜特异性CRISPR/Cas基因编辑系统，实现其内部目标基因的靶向编辑，我们依据条斑紫菜密码子偏好性对Cas12a基因进行序列优化并获得PyCas12a序列。另一方面，我们通过分析前期高盐高光处理后条斑紫菜转录组数据，筛选其中可能与外源蛋白表达稳定性相关的功能基因（转录辅激活因子PyCBP基因序列、RNA结合蛋白PABP1基因序列、泛素链接酶编码基因）。通过分子克隆手段我们成功获得PyCBP基因序列完整CDS片段。基于pEA7-PyAct1::PyAmCFP载体，我们成功构建PyCas12a及PyCBP-OE表达质粒。之后，通过基因枪转化法完成上述两种表达质粒的共转化操作，筛选适用于条斑紫菜功能基因编辑研究的底盘藻株，并计划后续进行核酸酶与sgRNA分步导入的大型海藻细胞的基因编辑策略。

（2）构建条斑紫菜PyM-LP2基因转化藻株

MPV17/PMP22蛋白家族是真核生物中普遍存在的一类蛋白质，可能在细胞内活性氧（ROS）代谢中发挥关键作用。前期转录组分析结果显示，条斑紫菜中存在三条MPV17/PMP22同源序列，其中PyM-LP2定位于过氧化物酶体，是具有多个跨膜区的通道蛋白。通过基因枪介导的质粒转化法获得了条斑紫菜PyM-LP2基因的过表达和RNA干扰藻株。实验结果表明，在高盐强光的组合胁迫压力下，与WT相比，过表达PyM-LP2基因的条斑紫菜叶状体具备更强的光合活性和更低的ROS积累量，而干扰株呈现与过表达株完全相反的生理参数变化趋势。而且在上述氧化胁迫条件下，与WT和干扰表达藻株相比,过表达PyM-LP2基因的藻体内还原力库容量和呼吸强度更大。这意味着PyM-LP2通过呼吸作用和还原力库容量的调控，参与了条斑紫菜的抗氧化胁迫能力的调控。其中，PyM-LP2可能作为过氧化物酶体的孔道蛋白，通过介导还原分子的转运而增强了藻体的光呼吸能力，从而缓减了细胞所受的氧化胁迫。

综上所述，本研究中构建了可能与增强外源蛋白表达稳定性相关的PyCBP表达质粒以及PyCas12a核酸酶表达质粒，并完成两种表达质粒的共转化操作。此研究工作旨在探索核酸酶与sgRNA分步导入的大型海藻的新型基因编辑策略，为基因编辑技术在新种质创制中的应用奠定基础。另一方面，基于同源重组的方法，我们成功获得抗氧化胁迫能力显著提升的条斑紫菜种质资源。这为未来抗氧化种质的培育奠定了坚实的理论基础和有力的技术支撑。