Institutional Repository of Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences
| ACTIN基因在两种海藻中的表达特征及其调控元件与标记开发 | |
许浩
| |
| 学位类型 | 硕士 |
| 导师 | 姜鹏 |
| 2024-05 | |
| 学位授予单位 | 中国科学院大学 |
| 学位授予地点 | 中国科学院海洋研究所 |
| 关键词 | 海带 浒苔 肌动蛋白基因 启动子 表达分析 |
| 摘要 | 肌动蛋白在真核细胞中普遍存在，稳定表达，几乎参与所有细胞生命活动。
ACTIN 基因多以基因家族的形式存在，从单细胞绿藻到高等植物，其家族成员不
断增多，功能也趋向分化，但多细胞藻类中的成员组成与表达特征尚不清楚。另
外，肌动蛋白基因（ACTIN）的启动子广泛应用于基因工程，为海藻遗传转化体
系的优化提供了理想的候选元件。本文以两种大型海藻为材料，在褐藻海带
（Saccharina japonica）中克隆了 ACTIN 基因及其上游序列，解析了基因结构及
其进化规律，研究了上游序列的启动子功能及其驱动基因在全生活史中的转录特
性；在绿藻浒苔（Ulva prolifera）生活史不同阶段，对两个 ACTIN 基因家族成员
分别进行了表达分析，取得以下主要研究结果：
1）分析了海带 ACTIN 基因的结构并验证了其启动子的功能
揭示海带 ACTIN 基因包含 3 个外显子和 2 个内含子，发现这一结构特征在
褐藻中具有普遍性，是植物中一种新型的 ACTIN 基因结构；克隆得到海带 ACTIN
基因上游一段 868 bp 的序列，经生物信息学方法预测，发现了启动子核心元件
与系列调控元件；将该序列分别与报告基因 lacZ 和 EGFP 融合构建了两个启动
子探测载体 pActin-βGal 和 pActin-EGFP，利用基因枪法将 pActin-βGal 导入海带
孢子体（2n）不同组织切块，经原位组织化学染色，发现 lacZ 基因在假根、叶
片等不同组织中均有表达；利用基因枪法将 pActin-EGFP 分别导入海带雌、雄配
子体（n），经荧光显微镜观察，发现 EGFP 基因在两性配子体中均有表达，上
述结果表明，克隆获得的海带 ACTIN 基因上游调控序列具有组成型启动子的功能，不具有组织或生活史阶段特异性。
2）揭示了浒苔 ACTIN 基因两个成员在生活史不同阶段的表达特征
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| 其他摘要 |
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| 学科门类 | 工学 ; 工学::生物工程 |
| 资助项目 | National Key Research and Development Program of China[2018YFD0901500] ; National Key Research and Development Program of China[2018YFD0901500] |
| 语种 | 中文 |
| 目录 | 摘 要.......................................................................................................... I
Abstract......................................................................................................III
第 1 章 绪论........................................................................................... 1
1.1 藻类基因工程研究进展.................................................................................... 2
1.1.1 藻类基因工程概述..................................................................................... 2
1.1.2 藻类基因工程的应用................................................................................. 3
1.1.3 大型藻类基因工程存在的问题与展望..................................................... 5
1.2 藻类 ACTIN 基因研究进展............................................................................... 5
1.2.1 植物肌动蛋白的发现................................................................................. 5
1.2.2 肌动蛋白的结构与功能............................................................................. 6
1.2.3 ACTIN 基因的相关研究.............................................................................. 7
1.3 大型海藻 UV 性别决定机制相关研究.............................................................9
1.3.1 植物的性别决定......................................................................................... 9
1.3.2 Ulva 属绿藻的性别相关研究....................................................................11
1.3.3 其它藻类的性别相关研究....................................................................... 12
1.4 本研究的目的与意义...................................................................................... 14
第 2 章 海带 ACTIN 基因启动子的克隆与功能验证.......................15
2.1 材料与方法...................................................................................................... 15
2.1.1 仪器与试剂............................................................................................... 15
2.1.2 藻株........................................................................................................... 16
2.1.3 海带 ACTIN 基因 cDNA 序列的扩增与系统发育分析..........................16
2.1.4 海带 ACTIN 基因 5’上游序列的克隆......................................................18
2.1.5 海带 ACTIN 基因启动子功能探测载体的构建...................................... 22
2.1.6 海带 ACTIN 基因启动子在海带中的功能验证...................................... 25
2.2 结果.................................................................................................................. 28
2.2.1 海带 ACTIN 基因 cDNA 序列的获得......................................................28
2.2.2 海带 ACTIN 基因序列的基因结构解析与系统发育.............................. 28
2.2.3 海带 ACTIN 基因 5’上游序列的克隆与调控元件分析..........................32
2.2.4 载体构建................................................................................................... 33
2.2.5 海带 ACTIN 基因启动子转化海带的结果.............................................. 35
2.3 讨论.................................................................................................................. 38
2.4 小结.................................................................................................................. 39
第 3 章 浒苔 ACTIN 基因 UpACT1 与 UpACT2 在生活史不同阶段的
表达分析................................................................................................... 40
3.1 材料与方法...................................................................................................... 40
3.1.1 仪器与试剂............................................................................................... 40
3.1.2 藻株........................................................................................................... 40
3.1.3 浒苔基因组 DNA 提取.............................................................................41
3.1.4 浒苔的生殖诱导及生活史不同阶段的构建........................................... 41
3.1.5 浒苔总 RNA 的制备................................................................................. 42
3.1.6 浒苔 cDNA 的合成................................................................................... 42
3.1.7 浒苔 ACTIN 基因 RT-qPCR 特异性引物设计........................................ 42
3.1.8 实时荧光定量数据分析........................................................................... 44
3.1.9 浒苔 ACTIN 基因的生物信息学分析...................................................... 44
3.1.10 浒苔 ACTIN 基因特异性引物的设计与扩增........................................ 45
3.1.11 浒苔生活史不同阶段中 UpACT1 和 UpACT2 基因的 PCR 鉴定....... 46
3.2 结果.................................................................................................................. 46
3.2.1 浒苔倍性和性别的鉴定与生殖诱导....................................................... 46
3.2.2 浒苔总 RNA 提取结果............................................................................. 47
3.2.3 RT-qPCR 引物特异性验证结果............................................................... 48
3.2.4 RT-qPCR 结果........................................................................................... 49
3.2.5 浒苔 ACTIN 基因的生物信息学分析...................................................... 50
3.2.7 浒苔生活史不同阶段中 UpACT1 和 UpACT2 基因的 PCR 鉴定......... 51
3.2.8 特异性引物的扩增结果........................................................................... 51
3.3 讨论.................................................................................................................. 52
3.4 小结.................................................................................................................. 53
第 4 章 结论与展望..............................................................................54
4.1 结论.............................................................................................................. 54
4.2 创新点.......................................................................................................... 54
4.3 展望.............................................................................................................. 54
参考文献................................................................................................... 55
附 录....................................................................................................... 67
致 谢....................................................................................................... 68
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果......69
|
| 文献类型 | 学位论文 |
| 条目标识符 | http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/185281 |
| 专题 | 实验海洋生物学重点实验室 中国科学院海洋研究所 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 许浩. ACTIN基因在两种海藻中的表达特征及其调控元件与标记开发[D]. 中国科学院海洋研究所. 中国科学院大学,2024. |
| 条目包含的文件 | ||||||
| 文件名称/大小 | 文献类型 | 版本类型 | 开放类型 | 使用许可 | ||
| ACTIN基因在两种海藻中的表达特征及其（4244KB） | 学位论文 | 暂不开放 | CC BY-NC-SA | |||
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