海洋生态与环境科学重点实验室知识库

在人类活动和气候变化双重压力下，全球有害藻华的发生频率和规模均呈现上升趋势，对海洋生态系统、水产养殖、公共卫生安全等造成了严重危害，引起全社会的关注。细胞层面上，有害藻华是一种藻细胞在外界刺激下内部稳态被打破，从而产生暴发性增殖的异常现象。离子通道和转运体以离子交换（产生离子流）的方式影响细胞内环境，是细胞内部稳态的主要调节者之一。电生理技术是研究生物个体、组织和细胞的电信号、膜离子通道及其生理效应的技术，其基本原理是利用电极引导生物电并进行记录和分析，进而研究和解释细胞中的离子调控机制和生理功能。本论文聚焦电生理技术在藻华生物研究中的应用，以我国近海典型有害甲藻——太平洋亚历山大藻（Alexandrium pacificum）为对象，首次建立了甲藻细胞层面的电生理方法；以硝酸盐转运和改性粘土对藻细胞的影响为例，借助该技术研究了太平洋亚历山大藻的电生理活动和响应特征；结合细胞生长状态、生理活性以及基因转录表达等，从电生理角度揭示了太平洋亚历山大藻细胞感受和适应环境的机制。本论文的主要研究结果如下：

（1）典型藻华生物电生理方法的建立：电生理技术在典型甲藻研究中的应用相对匮乏，主要与甲藻表面存在复杂的表质膜结构相关，该结构阻碍了电极与细胞膜的直接接触，因而不能记录到电信号。聚焦于该难点，本论文分别使用离心处理、低温处理和酶处理三种方法去除表质膜。研究发现，离心处理或低温处理能够诱导细胞脱去表质膜，而酶处理能够降解表质膜。三种方法去除表质膜获取的原生质体均能够被多聚赖氨酸固定，其中离心处理和低温处理的原生质体固定率相对较高，但仅有低温处理获得的原生质体能够被电极穿刺进入，适用于电信号记录。其中，最佳的诱导条件是在4℃低温下诱导2 小时。在此基础上，本论文通过改进穿刺式电压钳方法，应用于甲藻的电生理记录，并记录到包含外向钾离子（K⁺）电流和内向氯离子（Cl^-）电流的混合电流。

（2）改性粘土抑制甲藻细胞生长的电生理机制研究：本论文基于电生理技术，并结合细胞密度和形态变化、生理活性、基因表达等方面，研究了太平洋亚历山大藻在改性粘土铝系物质（聚合氯化铝PAC和氯化铝AC）处理下的应激响应情况。结果表明，铝系物质能够导致太平洋亚历山大藻细胞电生理记录中的正向整流电流下降，这一电生理变化反映了细胞活性的降低，与铝系物质对藻细胞产生的多重胁迫密切相关。铝系物质不仅破坏了细胞膜结构完整性，从而增加了膜通透性，还影响了离子泵的活性，部分铝离子甚至能够穿透细胞膜，对细胞内部结构和功能造成损害。这些生理层面的变化共同引发了藻细胞的形态改变和生长抑制，促进了暂时性孢囊的形成。作为应激响应，藻细胞激活了自身的抗氧化系统。同时，藻细胞为了应对铝系物质的胁迫，基因表达发生改变：以K⁺-ATPase为代表的细胞的跨膜运输系统和细胞内钙离子（Ca²⁺）转运的相关基因表达出现显著下调趋势，而金属离子排出、抗氧化系统、光合作用的相关基因则上调表达，共同构成了藻细胞对铝系物质胁迫的分子响应机制。值得注意的是AC和PAC均表现出抑藻效果，并且在相同浓度下AC作用更强。但考虑到铝对生物体的潜在风险，在安全浓度范围以内，PAC的相对温和性使其在实际应用中更具安全性。

（3）太平洋亚历山大藻对硝酸盐的电生理响应：本论文基于电生理、Ca²⁺荧光染色、转录组等技术，研究了太平洋亚历山大藻在硝酸盐饥饿适应（氮饥饿）和硝酸盐恢复供给（氮恢复）等处理过程中，藻细胞生长状态、硝酸盐吸收、电生理变化以及基因转录表达情况。结果表明，硝酸盐饥饿过程中，藻细胞停止生长，硝酸盐转运体NRT2.5基因上调表达，而硝酸盐转运体NRT2.1基因则下调表达。异源表达实验证实，NRT2.5具有更高的硝酸盐亲和性，能够促进硝酸盐的吸收。而在恢复硝酸盐供给后，藻细胞迅速吸收硝酸盐，细胞密度快速回升。此过程中甲藻细胞的正向电流显著下降，反映出内向阴离子电流的减少和其他阴离子的快速吸收，即硝酸盐快速吸收现象。同时，该过程出现硝酸盐刺激引发的膜电位去极化和细胞内Ca²⁺浓度上升，反映了细胞对硝酸盐刺激的感受和响应，并与转录组中氮饥饿下Ca²⁺通道和钙信号通路相关基因的上调相对应。由此推断甲藻通过调节NRT2.1和NRT2.5的表达比例来维持对硝酸盐的吸收能力，并上调钙信号通路的相关基因来增强感受能力，以适应不同的氮营养盐环境。

本论文填补了甲藻电生理研究的空白，将改进后的穿刺式电压钳方法应用于甲藻电生理研究，从电生理角度探明了改性粘土中铝系物质对太平洋亚历山大藻细胞的多重胁迫作用，比较了PAC和AC的抑藻作用差异，为阐释藻华治理机制提供了新的视角；发现了不同亲和性的硝酸盐转运体NRT2.5基因和NRT2.1基因在硝酸盐饥饿下的差异表达，揭示了硝酸盐恢复供给后，藻细胞电生理变化与硝酸盐快速吸收现象的关联，以及钙信号通路在硝酸盐感受与响应中的重要作用，为阐释甲藻适应不同氮营养盐环境提供了新见解。

综上所述，本论文突破了甲藻中原生质体获取的难点，建立了甲藻电生理方法。在此基础上研究了太平洋亚历山大藻在不同环境胁迫下的生理响应，揭示了改性粘土中铝系物质的抑藻机制，阐明了甲藻细胞的氮饥饿适应机制。本论文首次将电生理技术应用于有害藻华研究中，有害藻华的发生机制、控制策略等方面研究提供了新方法、新思路和新见解。

目录

第1章  绪论 1

1.1  有害藻华及改性粘土技术概述 1

1.1.1  有害藻华的主要危害和发展趋势 1

1.1.2  改性粘土方法治理有害藻华 1

1.2  电生理技术概述 4

1.2.1  细胞电生理技术的原理及主要类型 4

1.2.2  电生理技术在相关领域中的应用 7

1.2.3  细胞电生理技术在海洋藻类中的应用 8

1.3  电生理技术在藻华生物细胞研究中的应用 13

1.3.1  电生理技术在有害藻华生物中的应用 13

1.3.2  电生理技术在有害藻华研究中的展望 14

1.4  研究目标及内容 17

1.4.1  研究目标 18

1.4.2  研究内容 18

第2章  典型藻华生物电生理方法的建立 21

2.1  前言 21

2.2  实验材料和方法 22

2.2.1  实验材料 22

2.2.2  实验方法 24

2.3  结果 27

2.3.1  原生质体的获取及确认 27

2.3.2  原生质体的固定 29

2.3.3  电信号的记录和离子通道类型的初步确认 30

2.3.4  对漏电流的优化 33

2.4  讨论 34

2.4.1  原生质体的获得与固定 34

2.4.2  正向整流电流的记录和离子通道类型的确认 37

2.5  小结 38

第3章  改性粘土抑制甲藻细胞生长的电生理机制研究 39

3.1  前言 39

3.2  实验材料与方法 40

3.2.1  实验材料 40

3.2.2  实验方法 41

3.3  结果 47

3.3.1  改性粘土对藻细胞正向整流电流的影响 47

3.3.2  导致电流变化的主要因素分析 49

3.3.3  铝系物质对细胞生长的抑制和氧化胁迫作用 50

3.3.4  铝系物质对细胞膜通透性和离子泵活性的影响 53

3.3.5  铝系物质对细胞离子通道和离子泵基因表达的影响 56

3.4  讨论 59

3.4.1  正向整流电流变化对藻细胞生长的影响 59

3.4.2  导致细胞正向整流电流变化的原因分析 60

3.4.3  改性粘土对甲藻细胞的抑藻作用机理 63

3.5  小结 65

第4章  太平洋亚历山大藻对环境硝酸盐的电生理响应 67

4.1  前言 67

4.2  实验材料和方法 67

4.2.1  实验材料 67

4.2.2  实验方法 69

4.3  结果 75

4.3.1  氮饥饿及氮恢复过程中太平洋亚历山大藻细胞状态变化 75

4.3.2  氮恢复过程中藻细胞电信号变化特征 78

4.3.3  氮饥饿过程中藻细胞基因表达基因情况 79

4.3.4  藻细胞不同硝酸盐转运体的硝酸盐亲和性差异 84

4.3.5  氮饥饿条件下藻细胞对硝酸盐的感受能力变化 88

4.4  讨论 90

4.4.1  环境硝酸盐浓度对太平洋亚历山大藻生长的影响 90

4.4.2  太平洋亚历山大藻氮恢复过程中的电生理响应特征 91

4.4.3  藻细胞对氮饥饿适应的基因表达响应 93

4.5  小结 95

第5章  结论与展望 97

5.1  结论 97

5.2  创新点 97

5.3  不足与展望 98

参考文献 99

附录 123

致谢 147

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文 149