海洋生态与环境科学重点实验室知识库

        伪菱形藻属(Pseudo-nitzschia)多种物种是有害藻华(Hramful algal bloom, HAB)物种，不仅能够暴发形成藻华，并且能够产生失忆性贝类毒素(amnesic shellfish toxin, AST)——软骨藻酸(domoic acid, DA)。产毒伪菱形藻暴发赤潮后，产生的DA毒素能够沿着食物网传递，导致软体类、鸟类、海洋哺乳动物死亡，破坏生态环境，甚至危害人类生命安全。全球范围内发生了多起伪菱形藻赤潮暴发和DA含量过高导致的中毒事件，在中国海域也暴发了伪菱形藻赤潮事件。由于其危害性，伪菱形藻物种近三十年来一直受到国内外学术界广泛关注，并对伪菱形藻的多样性、产毒特性、分子生物学展开了大量的研究。
        然而由于伪菱形藻物种形态相似，基于形态特征的航次调查研究中难以准确鉴定每个伪菱形藻物种，结合分子标记序列的鉴定方法大大提高了伪菱形藻物种的分辨率，促使基于分子标记的宏条形码分析方法被广泛应用于鉴定海洋生态系统中的伪菱形藻物种的组成及其时空动态变化。然而，单基因分子标记也有一定的局限性，不能有效区分同属甚至同科物种，限制了对伪菱形藻属物种多样性的认识。高通量DNA测序技术的快速发展促进了基于高通量测序和生物信息学分析的细胞器基因组构建和比较分析，这些编码多个基因的超级条形码与单基因分子标记相比具有更高的分辨率，而与全基因组相比更加容易得到构建，极大宽展了针对伪菱形藻属物种多样性的分析。能够产生DA的物种在硅藻中比较罕见，而目前对伪菱形藻物种DA合成基因的认识还不足，DA合成基因是如何起源和演化尚不清楚。柔弱伪菱形藻作为中国海域经常出现的有害藻华物种在国外有产毒株系的报道，而在国内尚未有产毒报道，其产毒基因还尚未得到揭示。针对上述背景，本论文拟解决的关键科学问题包括：(1)利用宏条形码分析是否可以在中国近海鉴定更多的伪菱形藻物种，并解析其时空分布特征？(2)伪菱形藻物种产毒基因是如何起源，如何演化的？(3)是否可以通过构建全基因组找到柔弱伪菱形藻的产毒基因？
        本研究的主要成果包括：
        (1)利用基于18S rDNA V4分子标记序列的扩增和高通量测序(high-throughput sequencing)以及基于扩增子序列变异子(amplicon sequence variants, ASVs)的宏条形码分析(metabarcoding analysis)，鉴定胶州湾的伪菱形藻物种并追踪其时空动态。通过对胶州湾2019年12个月的航次样本进行分析，共计检测到22个ASVs被注释为伪菱形藻属的物种，并且检测到了以前在胶州湾基于形态学的生态学研究中未发现过的四个伪菱形藻物种，微孔伪菱形藻(P. micropora), 多纹伪菱形藻(P. multistriata)，银河伪菱形藻(P. galaxiae)和伪善伪菱形藻(P. fraudulenta)，显示了宏条形码分析在生态学研究中的优势。另外，通过比较分析发现不同伪菱形藻物种可能存在不同的时间偏好性，与多种环境因子如温度、盐度、SiO₃^2-等有着相关性。
        (2)通过高通量测序技术和生物信息学分析软件成功构建了9种伪菱形藻的叶绿体基因组(cpDNA)序列，8种伪菱形藻的线粒体基因组(mtDNA)序列和13种伪菱形藻的核糖体基因簇序列。其中8种伪菱形藻的叶绿体基因组和8种伪菱形藻的线粒体基因组以及13种伪菱形藻的核糖体基因簇是首次被构建，提供了有价值的分子资源。三种“超级条形码”在解析伪菱形藻物种的遗传进化关系时表现出了很高的一致性，都可以将伪菱形藻物种分为两个主要分支，并且物种的拓扑结构也高度一致，表明每一种超级条形码对相应伪菱形藻物种均具有很好的代表性。此外，还解析了伪菱形藻物种的叶绿体基因组、线粒体基因组的基因丢失现象，基因组结构差异等，帮助我们更好地认识伪菱形藻物种的遗传进化历程。针对高变区开发了伪菱形藻物种的高分辨率分子标记，可以用于追踪伪菱形藻的多样性。
        (3)通过高通量测序和生物信息学方法成功找到了尖细伪菱形藻(P. cuspidata)，多纹伪菱形藻，多列伪菱形藻(P. multiseries)三个伪菱形藻物种中包括全部4个dab基因的毒素合成基因簇，而曾经报导产毒并且在我国海域出现频次较高的尖刺伪菱形藻(P. pungens)和柔弱伪菱形藻(P. delicatissima)不具有这些dab毒素合成基因。通过毒性分析实验在多列伪菱形藻中检测到毒素，而多纹伪菱形藻的株系没有检测到毒素，表明多纹伪菱形藻的毒素合成可能存在特殊的调控机制。系统发育分析表明伪菱形藻物种的dab基因簇可能起源于他们的共同祖先，并且在伪菱形藻物种演化过程中发生了多次dab基因簇的丢失事件。
(4)构建了有害藻华物种柔弱伪菱形藻的核基因组序列，共计获得34.06 Mb的基因组，contig N50达到了2.9 Mb，经过Hi-C挂载后，32.86 Mb的基因组序列被定位到11条染色体上。在基因组中共注释到了14,375个基因，全基因组复制分析表明柔弱伪菱形藻近期不存在基因组复制事件。柔弱伪菱形藻基因组不具有产毒基因簇dab基因簇，也未检测到毒素的产生，表明柔弱伪菱形藻 CNS00130株系可能并不具备产毒能力。另外，对柔弱伪菱形藻中扩张和收缩的基因家族进行了解析，对柔弱伪菱形藻的光受体基因进行了比较分析，探究其对环境的独特适应机制。该参考基因组的构建为将来的赤潮暴发机制研究提供了平台。
        综上所述，本研究表明宏条形码技术在解析伪菱形藻物种多样性和分布特征上有一定的优势，可以应用于伪菱形藻组成和时空动态变化的生态学研究； “超级条形码”(叶绿体基因组、线粒体基因组、核糖体基因簇序列)可以有效区分伪菱形藻属物种，并在解析伪菱形藻物种的系统发育关系表现出了很高一致性；尖细伪菱形藻，多纹伪菱形藻，多列伪菱形藻具有毒素合成基因簇，是具有产毒潜力的有害藻华物种，伪菱形藻的毒素合成基因簇可能起源于共同祖先并发生了多次基因簇丢失事件；我国近海分布广泛、与多次赤潮事件有关的柔弱伪菱形藻可能不具有毒素合成基因以及合成软骨藻酸的能力。本论文的研究成果能够帮助深入认识中国海域伪菱形藻物种的多样性、生态分布和产毒特性，为伪菱形藻的监测和防治提供了数据支撑。

目 录

第1章 绪论... 1

1.1 伪菱形藻的生态重要性... 1

1.2 伪菱形藻多样性研究进展... 5

1.2.1 伪菱形藻分类学研究进展... 5

1.2.2 伪菱形藻航次调查研究进展... 9

1.3 伪菱形藻产毒特性研究进展... 13

1.3.1 伪菱形藻产毒能力研究进展... 13

1.3.2 伪菱形藻产毒基因研究进展... 14

1.4 伪菱形藻基因组学研究进展... 15

1.5 本论文拟解决的科学问题... 16

1.6 研究内容与意义... 16

第2章 胶州湾伪菱形藻宏条形码分析... 18

2.1 前言... 18

2.2 材料方法... 19

2.2.1 样品采集、DNA提取、PCR扩增和测序... 19

2.2.2 宏条形码数据分析... 21

2.3 结果... 22

2.3.1 胶州湾伪菱形藻物种的生物多样性... 22

2.3.2 胶州湾伪菱形藻物种的时空动态变化... 28

2.3.3 胶州湾伪菱形藻物种与环境因子的相关性分析... 30

2.4 讨论... 31

2.5 小结... 34

第3章 伪菱形藻叶绿体基因组比较分析... 35

3.1 前言... 35

3.2 材料方法... 36

3.2.1 伪菱形藻株系分离、培养与物种鉴定... 36

3.2.2 DNA提取及测序，分子标记组装，叶绿体基因组组装和注释... 37

3.2.3 系统发育分析... 39

3.2.4 共线性分析和IR区域分析... 40

3.2.5 叶绿体基因组比较分析及核苷酸多态性分析... 40

3.2.6 分化时间分析... 40

3.3 结果... 41

3.3.1 伪菱形藻株系的形态及分子鉴定... 41

3.3.2 伪菱形藻叶绿体基因组的构建及比较分析... 46

3.3.3 系统发育分析... 58

3.3.4 共线性分析... 62

3.3.5 IR区域分析... 64

3.3.6 选择压力分析及核苷酸多态性分析... 68

3.3.7 分化时间分析... 69

3.4 讨论... 70

3.5 小结... 73

第4章 伪菱形藻线粒体基因组比较分析... 75

4.1 前言... 75

4.2 材料方法... 75

4.2.1 伪菱形藻株系采样、分离、培养和形态学特征... 75

4.2.2 DNA提取、测序、分子鉴定... 76

4.2.3 线粒体基因组组装和注释... 77

4.2.4 系统发育分析... 77

4.2.5 共线性分析、比较基因组分析和核苷酸多态性分析... 77

4.2.6 分化时间分析... 78

4.3 结果... 78

4.3.1 伪菱形藻株系的鉴定... 78

4.3.2 伪菱形藻线粒体基因组的构建... 82

4.3.3 系统发育分析... 88

4.3.4 共线性分析... 90

4.3.5 基因组比较分析及核苷酸多态性分析... 93

4.3.6 分化时间分析... 96

4.4 讨论... 97

4.5 小结... 99

第5章 伪菱形藻核糖体基因簇比较分析... 101

5.1 前言... 101

5.2 材料方法... 101

5.2.1 株系分离鉴定与DNA提取与测序... 101

5.2.2 核糖体基因簇组装与注释... 102

5.2.3 系统发育分析... 102

5.3 结果... 102

5.3.1 核糖体DNA的构建... 102

5.3.2 系统发育分析... 103

5.4 讨论... 107

5.5 小结... 107

第6章 伪菱形藻产毒基因及毒素合成的比较分析... 108

6.1 前言... 108

6.2 材料方法... 109

6.2.1 伪菱形藻株系分离与形态鉴定... 109

6.2.2 DNA提取与测序与分子鉴定... 109

6.2.3 伪菱形藻dab基因的鉴定与注释... 109

6.2.4 蛋白质结构预测... 109

6.2.5 伪菱形藻株系毒性检测... 110

6.2.6 dab基因的系统发育分析... 110

6.2.7 共线性分析... 110

6.2.8 基于dabA基因引物的开发... 110

6.3 结果... 111

6.3.1 伪菱形藻株系鉴定... 111

6.3.2 伪菱形藻dab基因的鉴定与注释... 112

6.3.3 dab基因结构预测... 115

6.3.4 伪菱形藻毒性分析... 119

6.3.5 dab基因的系统发育分析... 120

6.3.6 共线性分析... 122

6.3.7 基于dabA基因引物的开发... 122

6.4 讨论... 123

6.5 小结... 126

第7章 柔弱伪菱形藻基因组的构建及比较分析... 127

7.1 前言... 127

7.2 材料方法... 128

7.2.1 柔弱伪菱形藻株系... 128

7.2.2 基因组DNA提取和测序... 128

7.2.3 RNA提取和测序... 128

7.2.4 污染评估与基因组大小估计... 128

7.2.5 基因组组装与评价... 129

7.2.6 基因组注释... 129

7.2.7 基因组进化与全基因组复制(WGD)分析... 130

7.2.8 dab基因及光受体基因分析... 130

7.3 结果... 130

7.3.1 基因组组装和注释结果... 130

7.3.2 全基因组复制分析... 134

7.3.3 系统发育分析及基因家族扩张收缩分析... 135

7.3.4 dab基因及光受体基因分析... 136

7.4 讨论... 140

7.5 小结... 141

第8章 结论与展望... 142

8.1 主要结论... 142

8.2 主要创新点... 144

8.3 研究展望... 144

参考文献... 146

附录一 伪菱形藻物种名录... 170

附录二 伪菱形藻物种分子标记统计... 173

附录三 伪菱形藻18S rDNA V4序列数据集... 176

致 谢... 178

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果... 179