海洋生态与环境科学重点实验室知识库

摘  要

有害藻华（Harmful Algal Blooms，HABs）是一种具有严重危害性的全球性海洋生态灾害，近年来其暴发呈加剧态势。基于“无污染、成本低、使用安全”等治理原则，粘土法是当前可大规模应用于有害藻华治理的主要方法。由于天然粘土存在治理效率低、用量大的问题，通过表面改性以提高粘土法的治理效率是推进该技术发展的关键。目前，粘土的有效改性方法主要包括无机改性和有机改性。近年来，在一些菌藻关系研究中发现，某些菌类微生物具有一定的溶藻作用，这为粘土改性提供了新的思路。

为此，本文以益生菌EM菌（Effective Microorganisms）为切入点，研究了生物改性粘土的制备方法；从EM菌中筛选出了具有溶藻作用的关键菌属芽孢杆菌，进一步优化了生物改性粘土；探讨了生物改性对粘土法治理有害藻华的增效作用。发现粘土经过生物改性后，可以通过促进溶藻微生物生长以及将微生物吸附、富集在其表面等方式提升其去除率，而其对溶藻物质（如侧孢短芽孢杆菌分泌的脂肽类物质）的吸附则是生物改性粘土溶藻能力提升的主要内在因素。主要研究结果如下：

1. EM菌改性粘土的制备与溶藻作用研究 为探讨生物改性的制备方式，本文以EM菌为改性剂制备生物改性粘土，以典型藻华生物东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）为研究对象，分析EM菌对粘土在藻华治理中的增效作用。研究结果表明，EM菌可以在藻华水体中稳定生存，并通过直接接触及分泌溶藻物质等方式有效抑制东海原甲藻生长；将其对粘土改性后，产生协同除藻效果，因此EM菌是一类适宜于与粘土复合改性并提升其除藻效率的生物材料。此外，适宜的熟化温度与时间能够促进EM菌的繁殖及其在改性粘土上的吸附，进一步提升生物改性粘土的除藻效率。

2. 侧孢短芽孢杆菌改性粘土的溶藻作用及其影响因素研究 为进一步验证并优化生物改性方法，选取EM菌中的优势菌——芽孢杆菌对粘土进行改性，通过分析侧孢短芽孢杆菌对粘土进行生物改性前后芽孢杆菌的生物量及除藻效率的变化，探究不同生物改性条件对粘土的增效作用的影响。结果表明，侧孢短芽孢杆菌改性对粘土治理赤潮异弯藻（Heterosigma akashiwo）具有增效作用，且增效作用随熟化时间的增加而增加；粘土粒径大小和种类对增效作用无显著影响。值得注意的是，当熟化时间＜24 h，随着熟化时间的增加，侧孢短芽孢杆菌的生物量与生物改性粘土的去除率均增加，且粘土可以将芽孢杆菌生物量提升1倍左右；当熟化时间为24-48 h时，随时间增长，微生物数量不变，而生物改性粘土中的溶藻能力仍上升。这初步说明生物改性对粘土的增效作用依赖于粘土对微生物生长的促进作用及侧孢短芽孢杆菌生长过程中分泌的溶藻物质。

3. 侧孢短芽孢杆菌的溶藻作用与机制研究 为揭示生物改性的增效机制，进一步研究了侧孢短芽孢杆菌的溶藻作用方式。通过初步提取侧孢短芽孢杆菌所分泌的溶藻物质并分析其对赤潮异弯藻的溶藻作用，结果表明，该菌株主要通过分泌溶藻物质发挥溶藻功能，该溶藻物质是一种分子量小于3500 Da的混合物，极性较大，在一定温度（-80.0至70.0 ℃）和pH范围（4.0-8.0）内性质稳定。这些溶藻物质在24 h内即可导致大部分赤潮异弯藻藻细胞破裂、内容物流出；对于剩余未破裂的藻细胞，该溶藻物质能够激活其抗氧化系统，降低其代谢活性，导致藻细胞出现皱缩、膜电位降低等凋亡现象。

4. 侧孢短芽孢杆菌溶藻物质的分离与鉴定 为深入阐释侧孢短芽孢杆菌的溶藻作用，进一步完善生物改性法的增效机制，本文进一步分离、鉴定了侧孢短芽孢杆菌所分泌的溶藻物质。利用制备液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）及质谱等方法，分离出侧孢短芽孢杆菌所分泌的有效溶藻组分，并进行结构鉴定。HPLC和基质辅助激光解析飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight mass spectrometry, MALDI-TOF）结果表明，侧孢短芽孢杆菌的溶藻粗提物中的有效组分有4种，其中组分2和3的溶藻性能最佳，且成分较为单一；通过LC-Q-TOF分析得到两种提纯产物的分子量分别为1273和1224。经MS-MS鉴定后，发现两种物质均为脂肽，氨基酸序列从碳端到氮末端依次为：① β-羟基脂肪酸—酪氨酸—谷氨酸—天冬氨酸—酪氨酸—缬氨酸—天冬酰胺—亮氨酸/异亮氨酸—酪氨酸和② β-羟基脂肪酸—酪氨酸—谷氨酸—天冬氨酸—亮氨酸/异亮氨酸—缬氨酸—天冬酰胺—亮氨酸/异亮氨酸—酪氨酸。两种脂肽的溶藻能力具有特异性，推测其作用位点可能在细胞膜上，使具有不同细胞结构的微藻生物对其表现出不同的耐受性。

本博士学位论文的创新点主要体现在：使用EM菌、芽孢杆菌对粘土进行改性，制备出生物改性粘土并探讨其制备条件；首次从侧孢短芽孢杆菌分泌物中分离出溶藻物质，经鉴定发现其为两种新型的脂肽类物质，该类物质是生物改性粘土溶藻的重要增效因素。

本论文揭示了生物改性对粘土法治理有害藻华的增效作用与机制，为藻-菌相互作用提供了重要参考，对研发兼具生态调控与应急处置作用的新型改性粘土具有重要指导作用。

目 录

第1章 绪论....................................................................................... 1

1.1 有害藻华概述.................................................................................................... 1

1.2 有害藻华的处置方法........................................................................................ 1

1.2.1 物理法......................................................................................................... 1

1.2.2 化学法......................................................................................................... 2

1.2.3 粘土絮凝法................................................................................................. 3

1.2.4 生物法......................................................................................................... 4

1.3 溶藻细菌研究进展............................................................................................ 6

1.3.1 常见溶藻细菌............................................................................................. 6

1.3.2 溶藻细菌作用方式..................................................................................... 6

1.3.3 溶藻细菌溶藻物质分离与纯化................................................................. 8

1.3.4 溶藻细菌在藻华防控中的应用................................................................. 9

1.4 微生物固定化研究进展................................................................................... 11

1.4.1 微生物固定方法....................................................................................... 11

1.4.2 微生物固定化载体................................................................................... 12

1.4.3 固定化溶藻细菌在藻华防控中的应用................................................... 13

1.5 研究目标及内容.............................................................................................. 13

1.5.1 研究目标................................................................................................... 14

1.5.2 研究内容................................................................................................... 15

第2章 EM菌改性粘土的制备与溶藻作用研究.............................. 17

2.1 前言.................................................................................................................. 17

2.2 材料与方法...................................................................................................... 17

2.2.1 实验生物和所用材料............................................................................... 17

2.2.2 实验设计................................................................................................... 18

2.2.3 分析方法................................................................................................... 19

2.2.4 数据处理................................................................................................... 20

2.3 实验结果.......................................................................................................... 20

2.3.1 EM菌对东海原甲藻的溶藻作用............................................................. 20

2.3.2 EM菌改性对粘土的溶藻作用影响......................................................... 21

2.4 讨论.................................................................................................................. 24

2.4.1 EM菌溶藻作用机制及其改性粘土复合后的影响................................. 25

2.4.2 EM菌中可能产生溶藻作用的优势菌种................................................. 27

2.4.3 EM菌改性粘土制备条件的影响............................................................. 28

2.5 小结.................................................................................................................. 30

第3章 侧孢短芽孢杆菌改性粘土的溶藻作用及其影响因素研究... 31

3.1 前言.................................................................................................................. 31

3.2 材料与方法...................................................................................................... 31

3.2.1 实验生物和所用材料............................................................................... 31

3.2.2 实验设计................................................................................................... 31

3.2.3 分析方法................................................................................................... 32

3.3 实验结果.......................................................................................................... 33

3.3.1 侧孢短芽孢杆菌改性粘土的溶藻作用................................................... 33

3.3.2 侧孢短芽孢杆菌改性粘土溶藻增效的影响因素................................... 35

3.4 讨论.................................................................................................................. 38

3.5 小结.................................................................................................................. 40

第4章 侧孢短芽孢杆菌的溶藻作用与机制研究............................. 41

4.1 前言.................................................................................................................. 41

4.2 材料与方法...................................................................................................... 41

4.2.1 实验生物和所用材料............................................................................... 41

4.2.2 实验设计................................................................................................... 41

4.2.3 分析方法................................................................................................... 43

4.2.4 数据处理................................................................................................... 44

4.3 实验结果.......................................................................................................... 44

4.3.1 侧孢短芽孢杆菌对赤潮异弯藻的溶藻方式........................................... 44

4.3.2 侧孢短芽孢杆菌溶藻物质的提取........................................................... 46

4.3.3 溶藻活性物质对温度和pH的耐受性.................................................... 46

4.3.4 侧孢短芽孢杆菌对赤潮异弯藻的溶藻作用机制................................... 47

4.4 讨论.................................................................................................................. 53

4.4.1 溶藻物质................................................................................................... 53

4.4.2 溶藻机制................................................................................................... 54

4.5 小结.................................................................................................................. 55

第5章 侧孢短芽孢杆菌溶藻物质的分离、鉴定研究...................... 57

5.1 前言.................................................................................................................. 57

5.2 材料与方法...................................................................................................... 57

5.2.1 溶藻粗提物的萃取................................................................................... 58

5.2.2 HPLC 分离纯化........................................................................................ 58

5.2.3 UPLC-ESI-Q-TOF分析............................................................................. 59

5.2.4 LC/Q-TOF及MS/MS分析....................................................................... 59

5.2.5 1号纯化物和2号纯化物的溶藻谱......................................................... 59

5.3 实验结果.......................................................................................................... 60

5.3.1 溶藻物质的分离....................................................................................... 60

5.3.2 溶藻物质的结构鉴定............................................................................... 63

5.3.3 芽孢杆菌所分泌的脂肽对不同藻华生物的溶藻作用........................... 68

5.3.4 脂肽改性粘土对除藻效率的影响........................................................... 71

5.4 讨论.................................................................................................................. 71

5.5 小结.................................................................................................................. 75

第6章 总结与展望.......................................................................... 77

6.1 结论.................................................................................................................. 77

6.1.1 论文创新点............................................................................................... 78

6.1.2 展望........................................................................................................... 78

参考文献........................................................................................... 79

致谢.................................................................................................. 95

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果..... 97