海洋地质与环境重点实验室知识库

深海中蕴藏着极为丰富的微生物资源，尤其是深海极端环境中的微生物，它们被认为可能与生命起源有关，而且绝大部分尚未被人类所知。在冷泉生态系统中，存在着多种多样的化能合成微生物，它们参与了冷泉区的甲烷、氢气、硫化氢等气体的产生与消耗过程，对全球碳循环、硫循环以及气候变化产生了重要影响。在不同的冷泉生态系统中，微生物的种类、数量以及其所驱动的代谢过程也有着一定的差异。由于采样及培养环境的限制，只有极小一部分微生物得以成功分离和培养，且目前关于它们的代谢产物研究通常需要在培养实验后进行取样，在此基础上再开展一系列的常规微生物学检测。由于深海环境是普遍缺氧的，因而这些微生物大多都是厌氧型，培养过程中往往需要严格控制培养装置内的各种条件。传统的取样检测方法旨在获取某一时刻的相关数据，无法对整个过程进行在线实时监控。目前，人们难以原位、无损、实时地获取培养装置内微生物代谢产物中气体组分的动态变化信息。本文采用激光拉曼光谱技术对从我国南海冷泉区沉积物中分离出的一株产甲烷古菌和产氢梭菌的产气代谢过程分别进行了在线的原位光谱采集，通过配置不同比例的混合气建立模型进行定量观测以及利用拉曼数据的半定量分析，实现了对该两株产气菌株产氢气和产甲烷代谢过程的原位无损观测，构建了封闭体系内微生物气体代谢产物的定量检测新方法。此外，本文还将该方法与气相色谱法所获取的数据进行了对比分析和验证。综上，本文侧重于方法学研究，完成了以下工作：

（1）构建新的原位在线无损检测方法

本文在厌氧封闭系统内连续原位无损检测方法匮乏的情况下，充分发挥激光拉曼光谱技术的优势，提出了一种基于拉曼光谱学的微生物气体代谢物检测新方法。进而在此基础上建立了一套可适用于各种拉曼光谱系统的微生物产气代谢过程的研究方案及数据采集方法。本文基于多次重复实验，探索出了合适的微生物培养容器、合适的拉曼内标峰、光谱的积分次数和积分时间等，最终基于遥测式拉曼探头和厌氧培养管建立了一套稳定的气体拉曼检测方案。该方案充分发挥遥测式探头的优越性，将激光聚焦到厌氧培养管内部菌液与培养基上方的顶空气体中，从而实现了对其气体组分的原位在线无损观测。这套实验方案和流程的适用范围很广，配合各种拉曼探头可以很方便地检测各种透光的封闭系统内气体环境的变化，从而可根据光谱数据描绘出各种气体组分的变化趋势。

（2）微生物产氢气和产甲烷过程的原位无损观测

在产氢气的研究方面，通过设置多次、多组不同的初始培养基底物条件，完成了不同底物环境下ZRK8菌株产氢代谢过程的半定量分析，并绘制了其随时间的产氢过程半定量趋势图。在产甲烷的研究方面，首先通过配置多组不同比例的甲烷-氮气二元混合气，基于遥测式拉曼探头获取了各组混合气的拉曼光谱。随后利用混合气的摩尔比与峰面积比进行回归分析，建立了二元混合体系中甲烷和氮气的拉曼定量模型。基于此模型，本文对一株从冷泉沉积物中新分离出的产甲烷古菌ZRKC1的产甲烷代谢过程进行了定量观测，利用拉曼光谱中的峰面积比数据计算出了每个时刻封闭体系内两种气体各自所占的比例，从而成功实现了对产甲烷过程的在线定量分析。

（3）气相色谱数据对拉曼光谱数据的验证及两种方法的对比

在产甲烷过程的定量观测实验中，本文引入了气相色谱法对所获取的拉曼定量数据进行了验证与对比。与气相色谱法相比，拉曼光谱法的优势在于：无需取样、无需进行气体的分离和转移、检测速度快，且能固定时间间隔进行连续的在线观测等。结果表明，在线拉曼光谱检测技术和气相色谱检测技术是互补的。一方面气相色谱可以提供检测限更低的结果，另一方面拉曼光谱则可提供快速、无损、原位的信息。二者的优势可以相互补充，在未来有望先使用拉曼光谱技术进行大量样品的快速初筛，随后再结合气相色谱对筛选出的样品进行更准确的数据获取及验证，从而大幅降低检测时间及成本。该方法的提出有望在未来应用于更多相关领域的研究中。