实验海洋生物学重点实验室知识库

海洋多毛类是海洋底栖生物类群之一，为适应海洋底层环境，进化出多样的适应性性状，其中最为典型的性状之一是“再生”。再生指生物体受到损伤或切除部分组织后重新生长出缺失的组织和器官，是《Science》公布的全世界最前沿的125个科学问题之一。再生在生物界是普遍的，但不同物种的再生能力存在巨大差异。目前从细胞角度解析多毛类再生机制的研究较少，尚处于早期阶段。

本研究以多毛类动物始初小头虫（Capitella teleta）和日本中燐虫（Mesochaetopterus japonicus）为研究对象，通过形态学观察、组织切片观察和免疫荧光染色观察两种多毛类的再生基本特征。然后通过5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）标记观察两种多毛类再生过程中是否有增殖细胞被募集到伤口处，同时通过EdU标签检测脉冲追踪策略（EdU pulse-chase）判断两种多毛类再生过程中的增殖细胞来源，明确再生过程中的增殖细胞募集特征。最后选取始初小头虫进行深入的再生细胞机制探究，通过10x单细胞转录组技术明确再生芽基组织的细胞类型，寻找潜在的小头虫干细胞样细胞类群，并通过原位杂交技术加以验证，以期对多毛类再生的基本特征和细胞机制多样性有进一步的认识，为以后系统性研究多毛类再生的细胞机制提供理论和数据参考。本研究的主要研究结果如下：

1. 本研究于中国沿海潮间带采集到小头虫科物种，形态上，物种的刚毛式为1-7体节背、腹带有细毛状刚毛，8-9体节缺少腹足叶细毛状刚毛，雌性8-9体节腹部为巾钩状刚毛。通过构建小头虫科内多个物种的线粒体细胞色素氧化酶亚基1 （mitochondrial cytochrome oxidase sunbunit I，COI）基因，16S rRNA基因和18S rRNA基因的系统发育分析树发现，此物种的COI序列、16S rRNA序列、18S rRNA序列与Capitella teleta物种划分在同一枝。结合形态学和分子序列判断此物种为Capitella teleta-中国群体，并命为始初小头虫。接下来我们对始初小头虫的再生能力进行了形态学观察和神经、肌肉的荧光染色观察，在再生12小时后可完成伤口愈合，3天后可以形成一个芽基组织，在5天后已有神经和肌肉的再生，在再生16天后可完成10多个体节的形成。通过EdU标记发现始初小头虫的尾部再生过程中会募集增殖细胞至伤口处，EdU pulse-chase实验发现，体内原有增殖细胞和伤口处细胞的去分化或转分化是小头虫再生增殖细胞的来源。通过羟基脲（hydroxyurea，HU）抑制细胞增殖过程发现小头虫无法再生，这表明增殖细胞对小头虫的再生是至关重要的。同时使用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV-939作用于再生中的小头虫，发现小头虫在再生3天后无法形成正常的再生芽基，且增殖细胞数量较对照组相比显著减少，这说明Wnt/β-catenin信号可能通过影响细胞增殖参与小头虫的再生过程。

2. 通过对1000条小头虫的再生芽基组织进行了单细胞转录组测序，总共捕获到23432个细胞，对得到的细胞进行数据质控、归一化后最终保留22984个细胞进行降维分析和差异基因分析。接下来结合组织特异性标记基因myosin，actin，syt1，vwc2l，nkx2.1a，hbnl，collagen，hemoglobin等确定了再生芽基组织中的肌肉细胞、神经细胞、后肠细胞、神经祖细胞、表皮细胞和红细胞类群。此外，通过已知的小头虫多能干细胞标记基因piwi1，vasa，PL10鉴定了芽基细胞类群，进一步将芽基细胞类群重新进行聚类分析成B0-B9共10个亚群，发现一类亚群表达和DNA复制相关的细胞周期早期基因，如msx2，mcm5；另一类亚群表达和染色体分离相关的细胞周期晚期基因，如mki67，cdk1，这说明可能在芽基细胞类群中存在着两种状态不同的细胞亚群，一类亚群正在进行DNA复制，而另一类亚群可能即将进入细胞分化阶段。随后我们进行了细胞周期早期基因msx2的原位杂交，通过实验发现，msx2在小头虫的1-5 dpa的芽基中表达，表达模式和vasa的表达模式类似，这表明表达msx2的细胞类群是潜在的小头虫再生干细胞样细胞类群。

3. 本研究对日本中燐虫不同位置进行了横向截断，发现它既可以头端再生，也能够尾端再生，且中燐虫头部再生的速度和能力优于尾部再生，前11个体节大约在1周内可以完成头部及丢失体节的再生，但是无法进行尾端再生；第11体节及其之后的体节都可以在约10天内完成尾部再生，但无法进行头端再生。头尾再生都会经历伤口愈合、芽基形成、组织分化和体节形成过程。其次，通过EdU标记发现日本中燐虫的头、尾再生早期都会募集增殖细胞至伤口处；随着再生的继续，增殖细胞增多并形成再生芽基；随着细胞分化的开始，增殖细胞数量也开始减少。同时通过EdU pulse-chase实验发现，中燐虫头、尾部再生中募集的增殖细胞有EdU⁺、PH3⁺和EdU⁺/PH3⁺细胞，这说明可能是原有增殖细胞和伤口处原有细胞去分化或转分化共同来源的。但结合羟基脲抑制实验发现，中燐虫的头部再生并未受到影响，而尾部却无法完成伤口愈合。这说明原有细胞的去分化或转分化是中燐虫头部再生增殖细胞的主要来源，而原有的增殖细胞是尾部再生增殖细胞的主要来源。

本研究以两种海洋多毛类再生性状为模型研究动物再生的细胞机制不仅是探讨生命科学规律的基础问题，更有助于加深我们对海洋底层生物多样性和海洋生物资源利用的认识。

第1章 绪论

1.1 再生细胞机制研究进展

1.1.1 水螅再生的细胞机制研究

1.1.2 蠕虫Acoel再生的细胞机制研究

1.1.3 涡虫再生的细胞机制研究

1.1.4 爪哇尾部再生的细胞机制研究

1.1.5 美西螈肢体再生的细胞机制研究

1.1.6 斑马鱼尾鳍、心脏再生的细胞机制研究

1.1.7 鹿茸再生的细胞机制研究

1.2 海洋多毛类动物介绍

1.2.1 海洋多毛类动物的定义、分类和进化关系

1.2.2 海洋多毛类再生研究

1.2.3 海洋多毛类再生演化研究

1.3 海洋多毛类再生机制研究进展

1.3.1 海洋多毛类再生分子机制研究

1.3.2 海洋多毛类再生细胞机制研究

1.4 单细胞转录组技术与再生研究

1.5 研究目的与意义

第2章 中国始初小头虫的物种鉴定和再生特征观察

2.1 材料与方法

2.1.1 样本采集与实验室养殖

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验仪器

2.1.4 始初小头虫的分子鉴定

2.1.5 始初小头虫的形态观察

2.1.6 整装免疫荧光标记和鬼笔环肽染色

2.1.7 羟基脲（Hydroxyurea）处理再生样本

2.1.8 Wnt通路抑制剂处理

2.1.9 EdU标记增殖细胞

2.2 研究结果与讨论

2.2.1 始初小头虫的形态观察

2.2.2 序列测序与系统发育树构建

2.2.3 始初小头虫的再生特征

2.2.4 Wnt/β-catenin信号通路参与始初小头虫的再生过程 31

2.3 结论

2.3.1 始初小头虫的物种鉴定

2.3.2 始初小头虫的再生特征观察

2.3.3 Wnt/β-catenin信号通路参与始初小头虫的再生过程

第3章 小头虫再生芽基的单细胞转录组分析

3.1 材料与方法

3.1.1 实验样本

3.1.2 实验试剂

3.1.3 实验仪器

3.1.4 流式细胞仪分选增殖细胞

3.1.5 密度梯度法分选小头虫增殖细胞

3.1.6 单细胞悬液制备

3.1.7 小头虫再生芽基单细胞悬液建库测序

3.1.8 单细胞数据的分析前处理

3.2 结果与讨论

3.2.1 小头虫体内增殖细胞的富集

3.2.2 小头虫再生芽基单细胞转录组数据基本特征

3.2.3 小头虫再生芽基单细胞数据质控及细胞聚类

3.2.4 小头虫再生血细胞

3.2.5 小头虫再生肌肉和血细胞混合群

3.2.6 小头虫再生表皮细胞

3.2.7 小头虫再生肌肉细胞

3.2.8 小头虫再生后肠细胞

3.2.9 小头虫再生神经细胞

3.2.10 小头虫再生芽基增殖细胞

3.2.11 芽基细胞亚群分析

3.2.12 其他细胞类型

3.3 结论

第4章 日本中燐虫的再生细胞机制研究

4.1 材料与方法

4.1.1 样本采集与实验室养殖

4.1.2 实验试剂

4.1.3 实验仪器

4.1.4 再生能力观察

4.1.5 组织切片的苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）

4.1.6 EdU标记再生增殖细胞

4.1.7 EdU pulse and chase实验

4.1.8 羟基脲处理再生样本

4.2 结果与讨论

4.2.1 不同体节的头、尾再生能力观察

4.2.2 头、尾再生中的增殖细胞变化

4.2.3 增殖细胞对再生的影响

4.2.4 再生细胞的来源

4.2.5 多毛类动物再生增殖细胞特征比较研究

4.3 结论

4.3.1 日本中燐虫的头尾再生特征

4.3.2 日本中燐虫再生细胞来源

4.3.3 环节动物多毛类再生增殖细胞特征比较研究

第5章 总结与展望

5.1 结论

5.2 创新点

5.3 研究展望

参考文献

致  谢

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果