真鲷（Pagrus major）和大菱鲆（Scophthalmus maximus）精子介导转基因的初步研究

IOCAS-IR > 海洋生物技术研发中心

	真鲷（Pagrus major）和大菱鲆（Scophthalmus maximus）精子介导转基因的初步研究
	郑君飘
学位类型	硕士
导师	李军
	2014-05
学位授予单位	中国科学院研究生院
学位授予地点	北京
学位专业	水产养殖
关键词	真鲷（pagrus Major）大菱鲆（scophthalmus Maximus）精子介导转基因
其他摘要	基因技术是改良生物性状的重要手段，其主要方法包括显微注射、精子介导法、电穿孔等。显微注射在鱼类的应用中存在一些技术难题，一直未有突破性的进展。精子介导法转基因（Sperm-mediated gene transfer，SMGT）操作简便、成本低，同时避开了鱼类受精卵各种特性的限制，在转基因鱼的制备中具有优势。目前鱼类SMGT技术应用仍处于初步阶段，存在不稳定，重复性差等问题，不同鱼种需要针对性地研究具体的精子介导方式和处理条件。真鲷（Pagrus major）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）是我国重要的海水养殖经济品种，本论文以这两种海水鱼为材料，研究分析外源DNA对其精子生理特性的影响及其转染效果，进一步实验探讨这两种海水鱼类SMGT技术的可行性和改进方法，主要结果如下： 1）外源DNA对真鲷精子活力的影响并不显著，仅在质粒pPmvasGFP达到2μg/106个精子的高浓度时，精子的运动速度稍有下降，5μg/106个精子的pPmvasGFP质粒孵育精子12h后，平均直线速度（VSL）相较于对照组低22.0%，但平均曲线速度（VCL）和精子活率（MOT）和并未减少。用pPmvasGFP和带荧光素标记的DNA片段孵育真鲷精子后，PCR检测和荧光观察发现，外源DNA吸附在部分精子表面（1μg/106个精子浓度处理下约31.90+5.65%），但并没有进入精子。经外源DNA处理的真鲷精子人工授精后，提取仔鱼基因组进行PCR检测，阳性率为0%，吸附在精子表面的外源DNA片段并没有转入子代产生转基因真鲷。 2）外源DNA下大菱鲆的精子活力变化与真鲷相似，影响不显著。带荧光素的DNA片段孵育大菱鲆精子后，荧光观察同样发现精子表面吸附有外源DNA。PCR检测发现，质粒pEGFP-N1通过直接孵育的方法不能进入大菱鲆精子，当用pEGFP-N1与脂质体的复合物处理大菱鲆精子时，精子基因组DNA中能够检测到外源DNA的信号。脂质体法SMGT处理大菱鲆精子后人工授精，提取仔鱼基因组进行PCR检测，阳性率为0%。根据结果推测外源DNA与脂质体形成复合体后，能够融合嵌于大菱鲆精子质膜当中，这部分外源DNA在精卵结合过程会被除去，不能转入子代产生转基因大菱鲆。以上研究表明，真鲷、大菱鲆精子并不具备自源吸收内化外源DNA的能力，直接孵育的SMGT方法在这两种海水鱼中较难实现。脂质体法虽然能使外源DNA融合嵌于精子质膜，仍然无法达到转基因的目地。游离在精子外部和吸附在精子表面的外源DNA，其浓度在较高水平下对精子活力的影响也不显著，进一步需要采取其它一些手段，使外源DNA真正穿透质膜进入精子内部。此外，本论文包含了与转基因相关的一些工作。通过染色体步移克隆了大菱鲆vasa基因的转录调控序列，分析潜在的核心调控序列并将其扩增连入pEGFP-N1载体，构建由vasa基因转录调控序列驱动的绿色荧光蛋白（GFP）表达载体pSMvasGFP，为进一步结合精子介导技术将载体转入大菱鲆，使GFP在大菱鲆原始生殖细胞（PGCs）中特异表达的研究提供基础。
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/18041
专题	海洋生物技术研发中心
推荐引用方式 GB/T 7714	郑君飘. 真鲷（Pagrus major）和大菱鲆（Scophthalmus maximus）精子介导转基因的初步研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院,2014.

条目包含的文件
文件名称/大小	文献类型	版本类型	开放类型	使用许可
真鲷（Pagrus major）和大菱鲆（3098KB）			限制开放	CC BY-NC-SA	浏览