栉孔扇贝（Chlamys farreri）凋亡相关基因功能研究

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	栉孔扇贝（Chlamys farreri）凋亡相关基因功能研究
	苗国英
学位类型	硕士
导师	阙华勇
	2014-05
学位授予单位	中国科学院研究生院
学位授予地点	北京
学位专业	生物工程
关键词	栉孔扇贝 Aps 基因 Bcl-2 家族基因 Bi-1 基因细胞凋亡
其他摘要	栉孔扇贝是我国重要养殖扇贝种类，自上世纪九十年代以来，养殖扇贝开始出现夏季大规模死亡等病害现象，造成巨大经济损失。大规模死亡的一个重要原因是扇贝的抗逆能力下降，培育高抗逆品系是解决规模死亡等问题的根本途径。本研究从栉孔扇贝机体的凋亡通路着手，研究与扇贝凋亡相关的基因，阐述其主要功能，为提高扇贝抗逆抗病能力和种质改良提供基础的实验数据和参考。本研究采用cDNA 末端快速扩增技术，从栉孔扇贝克隆得到CfIAP-1、CfIAP-2、CfBcl-2、CfBax 和CfBI-1 这五个凋亡相关基因的cDNA 全长，同时采用荧光定量PCR技术检测了这些基因的组织分布及在干露、脂多糖（LPS）和急性病毒性坏死症病毒刺激下的表达规律，另外还通过酵母双杂交技术及RNA 干扰技术研究了CfIAP-1、CfIAP-2 与CfCaspase3 之间的相互作用。栉孔扇贝IAP-1 基因（CfIAP-1）的cDNA 全长1552bp，开放阅读框为756bp，编码含有251 个氨基酸蛋白，预测该蛋白分子量为28.6 kDa，等电点为6.00，结构预测CfIAP-1 蛋白含有两个完整的BIR 结构域。系统进化分析显示，CfIAP-1 基因与凡纳滨对虾的IAP 基因聚为一枝，表明两者之间的BIR 结构域序列相似性较高。栉孔扇贝IAP-2 基因（CfIAP-2）的cDNA 全长为1243bp，开放阅读框为1071bp，编码含有356个氨基酸蛋白，预测该蛋白分子量为40.16 kDa，等电点为6.23，结构预测CfIAP-2 蛋白含有一个完整的BIR 结构域和一个RING 结构域。系统进化分析显示，CfIAP-2 与人的Livin 基因聚为一类，说明CfIAP-2 与Livin 之间的BIR 结构域序列和功能相似性较高。CfIAP-1 和CfIAP-2 的mRNA 在扇贝体内普遍存在于血淋巴细胞、闭壳肌、外套膜、性腺、消化腺和鳃组织中，CfIAP-1 在闭壳肌中的表达量最高，CfIAP-2 在鳃中的表达量最高。亚细胞定位结果显示，CfIAP-1 蛋白主要定位在细胞浆中，CfIAP-2 蛋白在细胞浆和细胞核中均有表达。在干露、LPS 及病毒刺激以后，CfIAP-1 和CfIAP-2 的表达水平较对照组均有显著上调（P<0.05），说明CfIAP-1 和CfIAP-2 基因可能参与了干露刺激、LPS 刺激和急性病毒性坏死症病毒感染后的细胞应激响应及其诱导的细胞凋亡过程。酵母双杂交实验结果为阴性，说明CfIAP-1 和CfIAP-2 和CfCaspase3 之间没有直接的相互作用，之后采用RNA 干扰技术，检测了CfIAP-2 基因的表达被抑制后，Caspase3 酶活的变化，结果表明，CfIAP-2 序列特异性siRNA 可以有效抑制该基因的表达，Caspase3 的酶活也有显著升高，说明CfIAP-2 可能会抑制Caspase3 的活性。栉孔扇贝Bcl-2 基因（CfBcl-2）的cDNA 全长为944bp，开放阅读框为678bp，编码含有225 个氨基酸蛋白，预测该蛋白分子量为24.99 kDa，等电点为5.71，结果预测该蛋白有四个BH 结构域，分别为BH1、BH2、BH3 和BH4 结构域，并且在C 端有一个跨膜结构域。栉孔扇贝Bax 基因（CfBax）开放阅读框为348bp，编码含有115 个氨基酸蛋白，预测该蛋白分子量为13.39 kDa，等电点为6.51，结构预测该蛋白有三个BH 结构域，分别为BH1、BH2 和BH3 结构域，在C 端有一个跨膜结构域。多序列比对和系统进化分析显示，栉孔扇贝Bcl-2 与牡蛎的氨基酸相似性最高，栉孔扇贝Bax与紫贻贝和牡蛎的氨基酸相似性最高。CfBcl-2 和CfBax 的mRNA 在栉孔扇贝检测的各组织中均有表达，其中CfBcl-2 在闭壳肌中的表达量最高，CfBax 在鳃中的表达量最高。在栉孔扇贝受到不同刺激后，CfBcl-2 和CfBax 基因的表达水平较对照组都有显著上调（P<0.05)，说明CfBcl-2 和CfBax 基因可能参与了由干露和LPS 刺激所导致的细胞凋亡过程及病毒刺激引起的细胞免疫反应，并且可能存在一定的相互作用，酵母双杂交实验结果证明CfBcl-2 和CfBax 基因在细胞中的确存在直接的相互作用，进一步验证了在栉孔扇贝的线粒体凋亡途径中，Bcl-2 和Bax 基因之间可通过形成同源或异源二聚体从而实现对细胞凋亡的调控作用。栉孔扇贝BI-1 基因(Bax inhibitor-1，CfBI-1)cDNA 全长序列，长度957bp，开放阅读框(ORF)为714bp，预测编码一个含有237 个氨基酸的蛋白质，分子量为27kDa,，结构预测显示，CfBI-1 蛋白包含6 个跨膜结构域。同源和分子进化聚类分析显示，CfBI-1蛋白序列与其它一些物种中的BI-1 蛋白序列相似性很高，表明BI-1 具有很高的保守性。通过荧光定量PCR 的方法检测了CfBI-1mRNA 在栉孔扇贝正常组织中和在干露、脂多糖以及扇贝急性坏死症病毒刺激之后的表达水平的变化。结果表明，CfBI-1 在栉孔扇贝各组织中广泛分布，其中闭壳肌中的表达量最高。在干露和病毒刺激以后，CfBI-1基因表达水平较对照组都有显著上调（P<0.05)，表明CfBI-1 基因可能参与了干露刺激和急性病毒性坏死症病毒感染后的细胞应激响应及其诱导的细胞凋亡过程。综上所述，栉孔扇贝的IAP 基因、Bcl-2 基因、Bax 基因和BI-1 基因在栉孔扇贝干露胁迫应激、免疫应答及细胞凋亡等过程中可能起重要作用，为栉孔扇贝凋亡、免疫等基础研究提供了参考，丰富了贝类凋亡相关研究的理论基础。
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/18026
专题	海洋生物技术研发中心
推荐引用方式 GB/T 7714	苗国英. 栉孔扇贝（Chlamys farreri）凋亡相关基因功能研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院,2014.

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栉孔扇贝（Chlamys farreri（3826KB）			限制开放	CC BY-NC-SA	浏览