凡纳滨对虾免疫基因SNPs开发及其与WSSV抗性的关联分析

IOCAS-IR > 实验海洋生物学重点实验室

	凡纳滨对虾免疫基因SNPs开发及其与WSSV抗性的关联分析
	刘敬文.
学位类型	硕士
导师	李富花
	2014-05
学位授予单位	中国科学院研究生院
学位授予地点	北京
学位专业	生物工程
关键词	Wssv 抗性选育凡纳滨对虾、wssv 抗性选育 Snps Snps 关联分析关联分析 Alfs Alfs 免疫信号通路免疫信号通路
其他摘要	凡纳滨对虾作为我国养殖产量最高的种类，在对虾养殖中占有举足轻重的地位，其可持续养殖一直为是对虾养殖业追求的目标。然而由于优良种质的缺乏以及对虾病害的频发严重影响着养殖业的健康可持续发展。对虾白斑综合症病毒（WSSV）以其致死率高、感染范围广、传播速率快、极难治愈的特征成为对虾养殖业的“头号杀手”。培育具有WSSV 抗性的对虾品系用于对虾养殖业，是从根本上解决种质和病害问题的唯一途径。由于抗性性状选择的复杂性，分子标记技术可以辅助选育工作，避免选育的盲目性并增加选育的进程。单核苷酸多态性（SNP）被认为是在遗传育种中最具发展前景的分子标记。本研究在凡纳滨对虾多个转录组数据的基础上，以选育品种“科海一号”的多家系种质库资源作为研究对象，对免疫相关基因SNPs 进行了验证及筛选，一方面研究了对虾重要免疫效应因子ALFs 在应答WSSV刺激时的表达变化及其多态性与抗性的相关分析，另一方面以免疫信号通路和多个效应因子基因为目标进行了抗性关联分析，以期获得与对虾抗WSSV 相关的SNP 标记，以指导对虾的抗性育种。主要进展如下： 1、根据基因注释信息，从solexa 测序和454 测序的数据库中分别筛出156条和86 条unigenes，共计242 条unigenes，其中56 条为免疫信号通路相关基因，186 条为免疫效应因子基因。通过对这些基因序列进行进一步的生物信息学分析，获得含1644 个SNPs (868 个来自solexa 测序数据库，776 个来自454 测序数据库) 的免疫基因的SNPs 初级库。从初级库中随机选取72 个位点进行了验证，确定以Q >20 (solexa) 和duel min ≥9 (454) 作为筛选高质量SNPs (预测准确率>85%) 的条件。将unigenes 序列与已有的部分基因组序列进行了比对，剔除无法在基因组序列中进行定位的位点，最终确定了由681 个SNPs 组成的免疫基因候选标记库 (solexa 中593 个， 454 中88 个)。 2、对从转录组中获得的6 个ALFs (nLvALF1、2、4、5、6、7) 基因进行了序列验证，这6 个ALFs 的开放阅读框 (ORF) 分别编码123、94、120、124、123、122 个氨基酸，它们的ORF 中均含有ALF 保守功能结构域-LPS 结合结构域 (LBD)，除nLvALF6 外其余五种ALFs 的LBD 均呈现正电性。序列比对和系统进化分析表明本研究中只有nLvALF4、7 为已有报道的LvALF，其余4 种均为新的亚型且与中国对虾ALFs 具有高度的相似性和同源性。6 种ALFs 在9 种组织 (Oka、肝胰脏、鳃、血细胞、肠、胃、心脏、表皮、眼柄) 中表达存在明显差异。在WSSV 感染后36-72h，感染组的nLvALF1、2、4、5、6 表达量均显著高于对照组 (P<0.05)，而nLvALF7 则为下调表达。推测各亚型ALFs 发挥了不同程度的作用。 3、以“科海一号”多家系种质库个体为材料进行了WSSV 感染实验，共历时19 天，取初期死亡的48 尾对虾作为易感组，最后存活的48 尾作为抗性组材料，对两组进行了病毒拷贝数检测发现其拷贝数存在极显著差异 (P<0.01)，推测抗性组体内发生了有效的病毒清除过程。将ALFs 基因序列与基因组信息进行比对及拼接后获得了不同ALFs 的基因组序列，然后通过扩增、测序获得了较完整的nLvALF1、2、4、6、7 基因组序列及SNPs 分布信息。凡纳滨对虾的nLvALFs具有较高的多态性，平均每21bp 存在一个SNP。选取这些ALFs 的部分SNPs在抗性组和易感组中进行了分型，结果表明，nLvALF1 内含子I 中的位点g.1361-T>C、g.1370-T>C、g.1419-T>A 的等位基因分布频率在易感组和抗性组间存在显著差异，其抗性优势等位基因分别为C、C、A。nLvALF2 及nLvALF6 中也发现了与WSSV 易感/抗性关联的SNPs 且均位于3’ UTR，nLvALF2 中g.2422A>G、g.2466 T>C 和g.2529 G>A 抗性优势基因型分别为AA、TT、AA，nLvALF6中g.2994 T>A 的AT 型与易感性相关。nLvALF1 的SNP 位点g.1415-C>A 和g.1419-T>A 组成的单倍型CT 与“科海一号”对WSSV 易感性显著相关。 4、通过高通量SNaPshot 分型技术对筛选出的三条主要免疫信号通路基因(JAK/STAT、Toll、IMD pathways) 的SNPs 和主要免疫效应因子SNPs 进行了分型，进而分析了各SNPs 与WSSV 抗性/易感性的关联性，结果表明，位点unigene30237 (STAM, 3’ UTR) 和unigene 16729 (TRAF6, nsSNP) 的基因型及等位基因型均与WSSV 抗性显著相关(P<0.05)，位点unigene 15411 (TLR, sSNP) 的G 等位基因在抗性组的发生频率远高于易感组 (P<0.05)，位点Unigene26970(Hemocyanin)的CT 型、Unigene34569 (Cu/Zn SOD, sSNP)的AA 型与WSSV 抗性相关(P<0.05)，位点Unigene34129-1 (未知基因, sSNP) 的CT 型及T 等位基因型在抗性组中的频率显著高于易感组(P<0.05)。本研究为ALFs 在对虾抗病毒免疫机制的功能研究提供了一定的辅助作用，通过关联分析获得的差异SNPs 可作为“科海一号”WSSV 抗性品种选育的分子标记。
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/18022
专题	实验海洋生物学重点实验室
推荐引用方式 GB/T 7714	刘敬文.. 凡纳滨对虾免疫基因SNPs开发及其与WSSV抗性的关联分析[D]. 北京. 中国科学院研究生院,2014.

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凡纳滨对虾免疫基因SNPs 开发及其与W（13470KB）			限制开放	CC BY-NC-SA	浏览