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柯氏潜铠虾（Shinkaia crosnieri Baba and Williams, 1998）分布于西北太平洋深海化能生态系统，是冲绳海槽及其附近热液和冷泉的优势物种，隶属于甲壳动物门，软甲纲，十足目，拟刺铠虾科。柯氏潜铠虾甲翼、胸板、螯足和步足的腹面长有发丝状刚毛，其上生长的大量化能合成的外共生菌是潜铠虾的重要营养来源。潜铠虾能很好的适应深海化能生态系统独特的环境与其附着的共生微生物关系密切，因此研究其共生菌的组成、代谢潜力能够帮助我们更好的认识柯氏潜铠虾对化能环境的独特适应机制。但是，深海调查取样较为困难，共生菌群组成复杂且不可培养，冷泉区柯氏潜铠虾共生菌还缺乏系统研究。另外，冷泉区渗漏的甲烷是重要的温室气体，同时也是潜铠虾共生菌的潜在能量来源和碳源。评估共生菌初级生产对化能生态系统的贡献始终是研究的难点之一，因为深海取样过程会导致大型生物与共生菌的状态发生改变，模拟深海环境也面临技术上的难题。本文选取我国台湾西南F冷泉区作为研究区域，对该区域内柯氏潜铠虾外共生菌相关问题进行了重点研究。具体地，我们通过宏基因组学和转录组学手段研究了外共生菌的组成，相对丰度和代谢潜力，并通过深海原位碳稳定同位素标记的方法探究了共生菌的固碳潜力和对宿主的支持作用。

首先，我们采取了宏基因组测序的方式，通过phyloFlash软件提取16S rDNA序列，对比了热液、冷泉区柯氏潜铠虾外共生菌群落以及冷泉潜铠虾生境环境微生物的物种组成和相对丰度。在目的水平上，冷泉区水体中微生物类群主要归属于黄杆菌目（19.5%），弯曲菌目（18.5%），甲基球菌目（9.1%）和硫发菌目（7.7%）；冷泉区潜铠虾共生菌主要归属于甲基球菌目（42.3%），硫发菌目（14.8%），弯曲菌目（4.9%），黄杆菌目（4.4%），噬几丁质菌目（3.8%）和亚硝化球菌目（2.2%）；热液区潜铠虾共生菌主要归属于弯曲菌目（44.6%）和硫发菌目（18.8%）。对比冷泉区固着生活的外共生菌和自由生活的环境微生物的组成差异，表明外共生菌不是环境微生物的简单复制。而对比热液区与冷泉区柯氏潜铠虾共生菌的组成，表明共生菌组成虽然有一定的宿主选择性，也受到环境因子的显著影响，因此有必要对冷泉区柯氏潜铠虾共生菌进行更进一步的探究。对不同门类高丰度的16S rDNA片段，我们通过FISH，观察到不同类型的细菌呈现多层环状分布特征，内侧分布的是短棒状的甲基球菌目细菌，外侧分布着长短不同的纤维状聚集体，包括硫发菌，弯曲菌，甲基球菌，黄细菌常常附着在纤维状细菌聚集体的表面。这种密集分布的形态非常有利于代谢产物在群落内部的交换。

其次，我们通过宏基因组学，结合组装和分箱技术，获得了97个共生菌基因组，共生菌的优势类群是甲基球菌目，硫发菌目，弯曲菌目，亚硝化球菌目，黄杆菌目和嗜几丁质菌目。甲基球菌编码了甲烷单加氧酶和后续的C₁代谢途径，少数MAGs通过sox通路进行硫氧化，具有反硝化通路和氨氧化能力；亚硝化球菌具有与甲基球菌目相似的C₁化合物的代谢能力，但缺少甲烷单加氧酶，不能直接利用甲烷；硫发菌通过CBB途径固碳，编码多条硫氧化通路，具有完整的反硝化通路，营养素的合成通路也比较完整；弯曲菌通过反三羧酸循环固碳，编码了完整的sox通路和硝酸盐氨化通路；黄杆菌和嗜几丁质菌都是具有反硝化能力的异养细菌，自身合成营养素的能力较弱，可能代表初级生产一部分有机碳的去路。分析过程中，我们发现某些重要代谢通路需要多个细菌共同完成，因此提出共生菌潜在的代谢互作，即亚硝基球菌可能部分依赖于从甲基球菌细胞泄漏的甲醇，硫氧化菌也可能通过共享稳定的硫中间体从其他细菌获利，硫发菌中编码并高表达羟胺氧化和甲醛氧化等解毒基因，异养型共生菌缺乏大部分氨基酸和辅酶的生物合成基因。以上代谢互作很好的印证了黑皇后假说，即代谢物渗漏导致微生物群落内合作的发生，稳定的合作会导致基因减少，各司其职的微生物提高群落整体的适应性。此外，共生菌为了适应冷泉动态多变的环境，在缺氧期，共生菌通过与硝酸盐呼吸偶联，将甲烷和硫化物氧化成甲醇和硫颗粒，稳定的硫和甲烷中间体可以作为内含物储存或释放到环境中并被其他共生菌吸收。在有氧阶段，外共生菌可以使用氧气氧化硫和甲醇，以额外的能量支持细胞生长。

为了定量研究柯氏潜铠虾共生菌的固碳潜力，我们设计了基于ROV的原位培养装置，分别使用¹³C标记的甲烷和二氧化碳，进行了原位模拟培养标记实验。实验发现，潜铠虾外共生菌¹³C同位素值显著升高，说明其可以使用甲烷和二氧化碳作为碳源，使用甲烷和硫化氢作为能量来源，潜铠虾甲烷氧化菌和硫氧化菌的固碳速率分别是20.2 μg/(g*h)和21.8 μg/(g*h)。为了探究静压力的改变对共生菌固碳速率的影响，并对原位固碳实验进行补充，我们开展了甲板实验室标记实验，甲板标记实验¹³CH₄实验组固碳速率为28.7−34.7 μg/（g*h），而¹³CO₂+Na₂S₂O₃实验组的固碳速率为6.6−22.0 μg/(g*h)，说明取样过程及静压力的改变不会马上导致化能共生菌死亡，且共生菌的固碳活动可以在常压下进行。甲板实验也很好的验证了原位实验获得的固碳速率的可靠性。为了定量研究共生菌向潜铠虾的碳传递路径和效率，我们对潜铠虾进行了原位的长时间标记培养实验，潜铠虾刚毛、肠道、肌肉中的单位质量碳同位素的增加量依次降低，表明共生菌的碳是通过摄食进入虾体内。此外，我们发现潜铠虾对共生菌的摄食具有选择性，甲烷共生菌向宿主的营养传递效率约为0.38%，而硫共生菌对宿主的营养传递效率约为1.31%，这种差异可能是共生菌的形态导致宿主的摄食难度不同导致的。根据共生菌的固碳速率和大型生物的丰度分布，我们发现生物密集区潜铠虾和贻贝氧化的甲烷约占该区域甲烷通量的23.49%，表明大型底栖生物对甲烷的过滤作用是不容忽视的。

本研究阐述了西太平洋冷泉、热液优势种柯氏潜铠虾外共生菌的组成和相对丰度及其差异，揭示南海冷泉区柯氏潜铠虾外共生菌组成。通过宏组学对共生菌群落优势类群代谢通路的研究，以及多角度验证实验，揭示其营养互作机制及其对冷泉波动环境的适应性。通过深海原位¹³C稳定同位素标记培养实验，首次定量测定了柯氏潜铠虾化能自养共生微生物固碳速率，评估了大型底栖生物对冷泉渗漏甲烷的过滤作用，为定量研究深海化能生态系统、天然气资源的开发利用的生态学影响提供了基础数据。