实验海洋生物学重点实验室知识库

红螯螯虾（Cherax quadricanatus）是近年来的新兴水产养殖物种，肉质鲜美具有较高的营养价值，其鲜艳多彩的外壳（蓝色、墨绿色或土褐色）也极具观赏性，可专门饲养赏玩，增加了其商业价值。红螯螯虾自引入我国以来，其养殖规模逐步扩大，对于红螯螯虾的研究也从初期对其生理特性和营养需求的探索，逐渐转入对其合理高效的养殖模式及深入的机理机制研究。本研究以红螯螯虾为研究对象，制备添加四种不同浓度虾青素（0 ppm，25 ppm，50  ppm，100 ppm）的红螯螯虾饲料，进行为期六周的养殖实验，实验结束，借助组织学、微生物16SrRNA基因测序技术、转录组学及分子生物学技术探究虾青素对红螯螯虾肝肠功能及体色产生影响的内在机制。研究结果如下：

1、饲料中添加虾青素对红螯螯虾生长性能及肠道菌群结构的影响

制备添加四种不同浓度虾青素的红螯螯虾饲料，0 ppm（AST-0）为对照组，保证粗蛋白含量约30%，粗脂肪含量约为5%，投喂红螯螯虾6周后，探究不同浓度虾青素对红螯螯虾生长性能和肠道微生物组成的影响。结果发现：三个实验组（AST-25，AST-50，AST-100）红螯螯虾的存活率、特定生长率以及增重率均高于对照组，且饲料中添加虾青素含量越高的组红螯螯虾的各项生长指标越高，但各组之间均不存在显著性差异（p > 0.05）。AST-0的蜕壳率最低，AST-50和AST-100的蜕壳率相等但高于AST-25组，各组之间也不存在显著性差异（p > 0.05）。肠道菌群测序结果则发现，红螯螯虾肠道中的优势菌门为变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes），25 ppm的虾青素对红螯螯虾肠道菌群结构的影响不明显，50 ppm和100 ppm的虾青素有利于变形菌门和拟杆菌门丰度的增加，而对厚壁菌门则有一定的抑制作用；在属水平上，实验组三种不同浓度的虾青素利于沙雷氏菌属的相对丰度的增加，但会抑制哈夫尼菌属的相对丰度。以上说明，饲料中添加虾青素对于红螯螯虾的生长性能起到了正向调节作用，但是实验组三种不同浓度虾青素对于红螯螯虾生长性能的调节差别不是特别明显；虾青素不会改变红螯螯虾肠道的优势菌群但会对优势菌群的丰度产生一定的调节作用。

2、红螯螯虾肠道及肝胰腺对饲料中添加虾青素的功能响应

用添加四种不同浓度虾青素的红螯螯虾饲料对红螯螯虾进行为期6周的养殖实验之后，探究虾青素对红螯螯虾肝胰腺和肠道功能的影响。结果发现，虾青素对红螯螯虾肝胰腺组织结构无明显影响，但有利于肠道组织结构的健康生长；对肝胰腺和肠道中的抗氧化基因表达特征分析发现，在肝胰腺中虾青素对SOD和Gpx的调节是先降低后升高，对CAT的调节则是先升高后降低，而在红螯螯虾肠道中，其具体调节模式表现为对SOD和GPx来说，饲料中添加100 ppm的虾青素更有利于其表达量的提高，对CAT来说，实验组三种不同浓度虾青素对其表达量均具有改善作用；对肝胰腺和肠道的消化相关基因表达情况分析发现，虾青素有利于促进红螯螯虾肝胰腺中α-淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶基因的表达，且在养殖的第6周明显提高了α-淀粉酶和脂肪酶基因的表达，养殖的第4周即明显提高了胰蛋白酶基因的表达，虾青素对于红螯螯虾肠道中α-淀粉酶、胰蛋白酶的调节作用与未添加虾青素组相比无明显差别，而对胰蛋白酶基因的表达量的调节表现为在第2周即明显促进其上调表达，随后表达量逐渐下降；在转录组水平上，红螯螯虾的肝胰腺被影响功能最多是与消化吸收和疾病相关的基因和通路，如在自噬过程中发挥重要作用的Cathepsin L基因在AST-25组显著上调；而肠道被影响最多的则主要是与色素代谢吸收及脂类代谢相关的基因和通路。以上说明，虾青素对红螯螯虾肠道组织结构具有有益作用，对于红螯螯虾肝胰腺和肠道的抗氧化性能均有调节作用，且调节的方式与具体的抗氧化基因有关，虾青素利于红螯螯虾肝胰腺和肠道消化功能的改善，但对肝胰腺消化功能的改善效果要比对肠道消化功能的改善效果更明显，同时虾青素的摄入促进了红螯螯虾肝胰腺的消化吸收及与免疫相关通路的响应，促进了肠道对色素吸收代谢和脂类代谢相关通路的响应。

3、虾青素对红螯螯虾体色的影响

用添加四种不同浓度虾青素的红螯螯虾饲料对红螯螯虾进行投喂，进行为期6周的养殖实验，比较虾青素对红螯螯虾体色的影响，随后专门以红螯螯虾的显著性特征“红膜”为研究目标，探究红螯螯虾雌雄螯色差异的原因。结果发现：AST-100组红螯螯虾壳色最深，且比较红螯螯虾各组织中虾青素的含量发现，红膜中虾青素含量最高，且虾青素多以游离态存在，而雌性红螯螯虾螯肢外侧角质层中的虾青素多以酯化形式存在，组学分析发现，具有抗钙结合和几丁质水解功能的基因对红色角质层的结构形成很重要，而需要钙离子激活的基因在红色角质层中被下调，且免疫相关基因不会在红膜处特殊高表达。WGCNA分析发现雄性红螯螯虾中有与其红膜表型性状密切相关的共表基因达模块，并进一步锁定三个关键基因。以上结果说明虾青素对红螯螯虾体色具有明显的调节效果，“红膜”作为红螯螯虾的典型性二态特征，是研究红螯螯虾颜色差异的理想组织样本。

4、红螯螯虾甲壳蓝蛋白（CqCRCNs）功能初探

以得到的转录组数据和已有的甲壳蓝蛋白基因为参考，克隆并分析了红螯螯虾的两种甲壳蓝蛋白，命名为CqCRCN-C1和CqCRCN-A2。对CqCRCN进行了生物学特性分析，发现CqCRCN-C1的cDNA编码区全长541 bp，编码181个氨基酸，分子量为22.246 kDa，含有一段由18个氨基酸残基组成的信号肽。CqCRCN-A2的cDNA编码区全长601 bp，编码201个氨基酸，分子量为23.581 kDa，含有一段由38个氨基酸残基组成的信号肽,且含有一段由13个氨基酸残基组成的跨膜结构域。并对CqCRCN-C1和CqCRCN-A2在不同组织，不同胚胎发育期和雌雄螯肢上皮中的表达情况进行分析，发现CqCRCN-C1和CqCRCN-A2主要在精巢、心脏、脱卵膜期开始以后的时期以及雌性螯虾螯肢上皮中高表达。此外，还对CqCRCN-C1进行了体外重组表达，并获得了纯化的重组蛋白。由以上结果可知，红螯螯虾中的甲壳蓝蛋白主要以CqCRCN-C1和CqCRCN-A2搭配组成的β-CRCN组成，CqCRCNs的分布规律与虾青素的分布密切相关，本研究中对CqCRCN-C1的体外重组表达也将为接下来表达纯化CRCN等大分子蛋白提供技术参考。