实验海洋生物学重点实验室知识库

褐藻多糖硫酸酯（fucoidan）是褐藻中的一种硫酸化杂多糖，具有抗炎症、抗凝血、抗肿瘤、治疗糖尿病肾病等生物活性。硫酸根含量和硫酸化位点是影响褐藻多糖硫酸酯生物活性的两个关键因素。从褐藻中提取的褐藻多糖硫酸酯并非均质化结构，其结构和组成随褐藻种类、生长时期和藻体部位等因素发生变化。而这种多变性和不确定性无疑阻碍了褐藻多糖硫酸酯构效关系的研究和应用。因此，我们对褐藻多糖硫酸酯合成途径中对底物进行硫酸化修饰的关键酶——磺基转移酶进行结构和体外表达研究。研究结果对于褐藻多糖硫酸酯的研究和应用具有重要意义。

基于海带全基因组和转录组数据，我们推测出褐藻多糖硫酸酯合成途径，注释到3个甘露糖-6-磷酸异构酶（MPI）基因，2个磷酸甘露糖变位酶（PMM）基因，2个GDP-甘露糖4，6-脱氢酶（GM46D）基因，22个岩藻糖基转移酶（FUT）基因，73个磺基转移酶（ST）基因和1个岩藻糖激酶（FK）基因。

通过结构域分析，筛选出44条具有高置信值的ST基因序列，并对其进行理化性质、基因定位、系统进化、可变剪接、二级结构等分析。44条ST基因含有丰富的内含子和可变剪接位点，定位在17个scaffolds和11个contigs，有5个串联重复基因簇，根据系统进化关系可分为5个亚家族（Group I-V），同一个亚家族内的成员具有相似的保守结构域。在海带孢子体不同部位和不同发育时期，ST基因具有不同的表达模式。转录组数据表明，超过一半的ST基因，在孢子体基部的表达量高于顶部。除ST5和ST28，其余基因的表达量随海带藻体的生长呈下降趋势。低盐（盐度16）和干出均能在短时间内引发海带ST转录水平的上升，表明褐藻多糖硫酸酯合成可能与海带受逆境的影响有关。

选取4条具有不同表达模式的ST基因（ST1，ST5，ST6和ST32）构建原核表达载体，利用大肠杆菌表达系统进行功能酶的体外表达。Western blot验证表明得到的重组蛋白为可溶性蛋白，且分子量符合预期大小。利用His-镍柱和superdex-200凝胶过滤柱对重组蛋白进行纯化后，经试剂盒和产物红外谱图验证，重组蛋白无活性。

利用毕赤酵母体系，表达海带ST1和ST6蛋白，培养基上清液中检测到的分泌蛋白浓度与対照组无明显区别，Western blot在浓缩上清液及菌体裂解液中未检测到可溶性重组蛋白，RT-PCR检测表明，ST1和ST6基因在重组毕赤酵母中的转录量较低，有的甚至无转录。另外，酿酒酵母表达的海带ST1和ST6蛋白，Western blot检测发现，在浓缩上清液及菌体裂解液中均未检测到可溶性重组蛋白条带，RT-PCR能够得到明亮的电泳条带，表明ST1和ST6基因在重组酿酒酵母中的转录量较高，但仍需进一步探究重组蛋白未能表达的原因。对重组酿酒酵母进行盐度胁迫（氯化钠浓度为0.9 M，1.0 M，1.1 M，1.2 M，1.3 M，1.4 M），在相同生长条件下，转基因酵母的生长速度及对氯化钠的耐受能力均低于野生型。

构建pPhaT1-ST1-eGFP表达载体，将重组载体转进三角褐指藻体系中，实现了海带ST1基因在三角褐指藻基因组中的整合，利用荧光显微镜在转基因藻株中观察到明亮的绿色荧光，表明已实现ST1和eGFP（enhanced green flurescence，增强绿色荧光蛋白）融合蛋白的表达，但Western blot验证发现融合蛋白的分子量偏低。

探究磺基转移酶的结构与体外表达不仅对了解褐藻多糖硫酸酯生物合成途径具有重要意义，也为利用生物法对褐藻多糖硫酸酯进行改性修饰打下基础。

第1章 引言.... 1

1.1 海洋硫酸化多糖来源... 1

1.1.1 海洋藻类... 1

1.1.2 海洋无脊椎动物... 3

1.2 褐藻多糖硫酸酯... 3

1.2.1 结构与组成... 4

1.2.2 提取与纯化方法... 7

1.2.3 生物活性... 9

1.2.4 构效关系... 11

1.2.5 生物合成途径... 13

1.3 磺基转移酶... 14

1.3.1 磺基转移酶种类... 15

1.3.2 硫酸化... 18

1.3.3 磺基转移酶的来源... 18

1.3.4 结构域预测分析... 21

1.4 多糖硫酸化修饰... 23

1.4.1 化学法... 23

1.4.2 酶法... 24

1.5 研究目的与意义... 25

第2章 海带磺基转移酶基因家族分析及基因在胁迫条件下表达.... 27

2.1 实验材料... 27

2.1.1 样品处理... 27

2.1.2 实验仪器及试剂... 27

2.2 分析方法... 28

2.2.1 RNA提取及反转录... 28

2.2.2 褐藻多糖硫酸酯基因序列的筛选... 29

2.2.3 海带基因组中磺基转移酶的鉴定... 29

2.2.4 序列分析及染色体定位等分析... 29

2.2.5 可变剪接分析... 30

2.2.6 系统进化树建立... 30

2.2.7 不同生长发育时期和组织中磺基转移酶基因的转录水平分析... 30

2.2.8 干出和低盐对磺基转移酶基因的转录影响... 31

2.3 分析结果... 32

2.3.1 褐藻多糖硫酸酯合成途径基因的筛选及转录谱分析... 32

2.3.2 ST基因筛选与分析... 33

2.3.3 ST序列结构及系统进化分析... 40

2.3.4 ST序列的可变剪接事件... 43

2.3.5 ST序列的scaffold定位和基因复制... 43

2.3.6 ST蛋白二级结构预测分析... 45

2.3.7 海带不同部位及发育时期的ST转录本分析... 48

2.3.8 差异表达基因的转录趋势和功能富集... 50

2.3.9 干出和低盐对ST转录影响... 52

2.4 讨论... 54

2.5 小结... 56

第3章 磺基转移酶基因在大肠杆菌中的表达研究.... 57

3.1 实验仪器及试剂... 57

3.2 实验方法... 61

3.2.1 ST基因的扩增及克隆载体的构建... 61

3.2.2 ST的体外表达及纯化... 64

3.2.3 重组蛋白酶活探究... 69

3.3 实验结果... 71

3.3.1 ST基因克隆... 71

3.3.2 ST表达载体的构建... 73

3.3.3 ST重组蛋白的表达和纯化... 75

3.3.4 ST重组蛋白的酶活检测... 77

3.4 小结... 79

第4章 磺基转移酶基因在酵母中的表达研究.... 81

4.1 实验仪器及试剂... 81

4.2 ST在毕赤酵母中的表达... 83

4.2.1 实验方法... 83

4.2.2 实验结果... 87

4.3 ST基因在酿酒酵母中的表达... 91

4.3.1 实验方法... 91

4.3.2 实验结果... 94

4.4 小结... 98

第5章 磺基转移酶基因在三角褐指藻中的表达研究.... 99

5.1 实验材料... 99

5.1.1 实验藻种... 99

5.1.2 实验仪器及试剂... 99

5.2 实验方法... 100

5.2.1 ST1基因克隆与pPhaT1-ST1-eGFP载体构建... 100

5.2.2 重组质粒转化三角褐指藻... 100

5.2.3 藻落PCR.. 101

5.2.4 硅藻蛋白提取... 101

5.2.5 SDS-PAGE及Western blot 101

5.3 实验结果... 101

5.3.1 藻落PCR.. 101

5.3.2 荧光镜检... 101

5.3.3 Western blot 103

5.4 小结... 103

第6章 结论.... 105

参考文献... 107

附 录... 121

致 谢... 137

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果    139