实验海洋生物学重点实验室知识库

虾青素是一种极强的抗氧化剂和着色剂，在多个行业领域都具有非常广阔的应用前景。雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）作为天然虾青素最优质的生物来源，一直备受市场关注。探究并阐明雨生红球藻虾青素合成的调控机制对提高虾青素产量具有重要意义，已成为研究热点。但此前研究主要关注依赖于光的代谢途径与虾青素合成的关系，而对于不依赖于光的呼吸代谢途径在虾青素合成过程中发挥的作用及具体机制了解甚少。本研究创新性地以呼吸代谢途径之一的三羧酸（TCA）循环作为切入点，研究了外源添加直接或间接参与TCA循环的代谢物对雨生红球藻虾青素积累的影响，分析了呼吸代谢途径的变化与虾青素积累之间的密切关系，旨在探讨并阐明TCA循环在虾青素积累过程中的作用及调控机制。

主要的研究内容及结果如下：

1. 研究了外源添加8种不同的TCA循环代谢物（丙酮酸、草酰乙酸、柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸和苹果酸）对雨生红球藻虾青素积累的影响，初步确定外源添加TCA循环代谢物可以促进雨生红球藻虾青素积累。

2. 以延胡索酸为例，通过研究其对细胞生长以及光合、呼吸等初生代谢的影响探究了其促进雨生红球藻虾青素积累的具体机制。结果表明，外源添加延胡索酸后，雨生红球藻细胞中虾青素的含量明显增加，且缺氮条件下增加更明显。同时，外源添加延胡索酸增强了呼吸速率及呼吸代谢途径，提高了糖酵解途径、磷酸戊糖途径和TCA循环中代谢物的水平，一方面通过提高虾青素从头合成所需的底物（丙酮酸和3-磷酸甘油醛）和还原力（NADH和NADPH）的水平而直接促进了虾青素的合成，另一方面提高了脂肪酸的含量，进而通过促进虾青素酯的形成间接促进了虾青素的积累。

3. 以草酰乙酸为例，通过研究其对细胞生长及光合、呼吸等初生代谢的影响探究了其促进雨生红球藻虾青素积累的具体机制。结果表明，外源添加草酰乙酸后，雨生红球藻细胞中虾青素和虾青素酯的含量均明显增加，且缺氮条件下增加更明显。同时，外源添加草酰乙酸促进了呼吸作用抑制了光合作用，提高了糖酵解途径、磷酸戊糖途径和TCA循环中代谢物的水平，呼吸代谢途径的增强使得虾青素从头合成所需的底物和还原力水平提高，进而促进了虾青素的积累。

4. 研究了能够转化为TCA循环代谢物的谷氨酸和天冬氨酸对雨生红球藻虾青素积累的影响，探究其是否通过间接参与TCA循环而影响虾青素合成。结果表明，外源添加谷氨酸和天冬氨酸明显提高了雨生红球藻细胞中虾青素的含量。同时，外源添加谷氨酸和天冬氨酸都提高了TCA循环代谢物的水平，促进了糖酵解途径、磷酸戊糖途径和TCA循环三大呼吸代谢途径的进行，进而通过提高虾青素和脂肪酸合成所需的底物和还原力水平而促进虾青素积累。

5. 研究了辅酶A（CoA）合成前体泛酸对雨生红球藻虾青素积累的影响，探究其是否通过间接参与TCA循环而影响虾青素合成。结果表明，外源添加泛酸促进了雨生红球藻的生长和光合能力，但抑制了虾青素的合成。此外，藻细胞内泛酸的含量明显增加，TCA循环中柠檬酸、异柠檬酸和苹果酸的含量显著增加，而糖酵解途径中磷酸己糖及其裂解产物的含量降低。由此推测，外源泛酸促进了雨生红球藻中CoA的合成，进而促进了丙酮酸向乙酰CoA的转化，使得3-磷酸甘油醛和丙酮酸作为底物流向虾青素合成的通量明显下降而抑制了虾青素的合成。

综上，本文研究表明TCA循环通过调节呼吸代谢途径影响虾青素合成所需的底物和还原力水平进而影响虾青素积累，揭示了TCA循环在虾青素积累过程中发挥着关键的调控作用。研究结果不仅为进一步深入了解雨生红球藻虾青素合成的调控机制提供了新的见解和参考，也为通过人工调控手段提高虾青素的生产效率提供了更多思路和依据。

第1章　绪论 1

1.1　虾青素 1

1.1.1　虾青素的结构特性 1

1.1.2　虾青素异构体 2

1.1.3　虾青素的来源 4

1.1.4　天然虾青素的应用 4

1.2　雨生红球藻中虾青素的合成及调控 7

1.2.1　虾青素的合成过程 7

1.2.2　诱导虾青素合成的方法 10

1.2.3　其他代谢过程对虾青素合成的调控 13

1.3　呼吸代谢途径 16

1.3.1　糖酵解途径 16

1.3.2　磷酸戊糖途径 18

1.3.3　三羧酸循环 19

1.3.4　呼吸代谢与虾青素合成的关系 21

1.4　研究目的、内容及意义 22

第2章　外源添加三羧酸循环代谢物对虾青素积累的影响 25

2.1　引言 25

2.2　材料与方法 25

2.2.1　藻种与培养基 25

2.2.2　培养方法 26

2.2.3　实验指标观测 27

2.3　结果与讨论 27

2.4　结论 32

第3章　外源延胡索酸促进雨生红球藻虾青素积累的机制 33

3.1　引言 33

3.2　材料与方法 33

3.2.1　藻种与培养基 33

3.2.2　培养方法 33

3.2.3　实验指标的测定 34

3.2.4　初生代谢组的检测与分析 35

3.2.5　数据处理与统计分析 36

3.3　结果与讨论 36

3.3.1　延胡索酸对藻细胞密度和虾青素含量的影响 36

3.3.2　延胡索酸对光合和呼吸生理指标的影响 38

3.3.3　初生代谢组的变化 41

3.3.4　延胡索酸对呼吸代谢途径的影响 42

3.3.5　延胡索酸对游离脂肪酸含量的影响 45

3.3.6　延胡索酸促进虾青素积累的机制分析 47

3.4　结论 48

第4章　外源草酰乙酸促进雨生红球藻虾青素积累的机制 49

4.1　引言 49

4.2　材料与方法 49

4.2.1　藻种与培养基 49

4.2.2　培养方法 49

4.2.3　实验指标的测定 50

4.2.4　初生代谢组的检测与分析 51

4.2.5　数据处理与统计分析 51

4.3　结果与讨论 51

4.3.1　草酰乙酸对藻细胞密度和虾青素含量的影响 51

4.3.2　草酰乙酸对光合和呼吸生理指标的影响 53

4.3.3　初生代谢组的变化 55

4.3.4　草酰乙酸对呼吸代谢途径的影响 56

4.3.5　草酰乙酸对游离脂肪酸含量的影响 60

4.3.6　草酰乙酸促进虾青素积累的机制分析 61

4.4　结论 63

第5章　外源添加谷氨酸和天冬氨酸对虾青素积累的影响 65

5.1　引言 65

5.2　材料与方法 65

5.2.1　藻种与培养基 65

5.2.2　培养方法 65

5.2.3　实验指标的测定 66

5.2.4　初生代谢组的检测与分析 66

5.2.5　数据处理与统计分析 67

5.3　结果与讨论 67

5.3.1　谷氨酸和天冬氨酸对藻细胞密度和虾青素含量的影响 67

5.3.2　谷氨酸和天冬氨酸对光合指标的影响 68

5.3.3　初生代谢组的变化 69

5.3.4　谷氨酸和天冬氨酸对呼吸代谢途径的影响 72

5.3.5　谷氨酸和天冬氨酸对氨基酸含量的影响 75

5.3.6　谷氨酸和天冬氨酸对游离脂肪酸含量的影响 77

5.3.7　谷氨酸和天冬氨酸促进虾青素积累的机制分析 78

5.4　结论 80

第6章　外源添加泛酸对虾青素积累的影响 81

6.1　引言 81

6.2　材料与方法 81

6.2.1　藻种与培养基 81

6.2.2　培养方法 81

6.2.3　实验指标的测定 82

6.2.4　初生代谢组的检测与分析 82

6.2.5　数据处理与统计分析 82

6.3　结果与讨论 82

6.3.1　泛酸对藻细胞密度和虾青素含量的影响 82

6.3.2　泛酸对光合参数的影响 83

6.3.3　初生代谢组的变化 84

6.3.4　泛酸对呼吸代谢途径的影响 86

6.3.5　泛酸对游离脂肪酸含量的影响 89

6.4　结论 90

第7章　结论与展望 91

参考文献 93

附　录 111

致　谢 113

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 115