鱼类病原菌的快速诊断与免疫防控

IOCAS-IR > 实验海洋生物学重点实验室

	鱼类病原菌的快速诊断与免疫防控
	于兰萍
学位类型	博士
导师	孙黎
	2013-05
学位授予单位	中国科学院研究生院
学位专业	海洋生物学
关键词	Mlamp 哈氏弧菌鳗弧菌溶藻胶弧菌海豚链球菌疫苗
摘要	环介导等温扩增技术是一种新兴的核酸检测方法，利用4个特异性引物在等温条件下对目的DNA进行扩增。本研究设计了3套LAMP引物，建立了同时检测哈氏弧菌、鳗弧菌和溶藻胶弧菌的多重环介导等温扩增方法（mLAMP）。结果发现，62℃反应60 min时可以同时检测3种弧菌的存在；通过限制性酶切分析，可以区分3种弧菌。mLAMP的灵敏性比PCR方法高102到103倍。选择32株细菌样本作为mLAMP检测的模板，发现3套引物均能特异性地扩增相关种的细菌，其他菌株均呈阴性反应。以牙鲆作为试验动物，对mLAMP的实用性进行了评价。分别取健康牙鲆及细菌感染的牙鲆的组织进行mLAMP检测，发现可以成功检测并鉴定感染细菌的种类。这些结果说明，本研究中建立的mLAMP方法是一种简单、有效的检测方法，可以应用于病原菌的早期诊断。鳗弧菌、海豚链球菌和哈氏弧菌是世界范围内水产养殖动物的主要致病菌。在本研究中，通过利福平抗性筛选获得了鳗弧菌抗性突变株C312M和海豚链球菌抗性突变株SF1M1。研究表明，C312M和SF1M1均比其野生型生长缓慢、具有降低的细胞外蛋白酶活性和铁载体。较之于野生型，突变株的蛋白图谱发生了明显的改变，其半致死剂量明显提高。安全性分析表明：突变株在选择压力缺失的条件下其毒力是稳定的。为了评价C312M和SF1M1突变株作为减毒活疫苗的可能性，将其分别免疫牙鲆。结果发现，在免疫一个月后经鳗弧菌C312感染，C312M免疫组有60-84%的相对存活率。在免疫一个月和两个月后，不同血清型（I型和II型）海豚链球菌攻毒，发现SFIM1免疫组有54-70% 的相对存活率。进一步分析表明：C312M及SF1M1免疫组能够产生特异性的血清抗体，该抗体能够通过补体依赖方式增强血清杀菌能力。以上结果说明：C312M及SF1M1的毒力大幅降低，但仍具有一定的感染能力，可以作为有效的减毒活疫苗使用。对13个哈氏弧菌的外膜蛋白（OMPs）进行克隆、表达并分析了它们的免疫学性质。体内免疫原性分析显示，在哈氏弧菌感染的鼠抗血清中能够检测到针对13个重组蛋白OMPs的特异性抗体。OMPs作为亚单位疫苗免疫后，均能在免疫牙鲆中产生特异性的血清抗体。2个OMPs（OMP173和OMP214）可以诱导产生高水平（> 70%）的相对存活率。有保护作用的OMPs抗血清与哈氏弧菌孵育后，可以显著削弱细菌对牙鲆FG细胞的感染，而没有保护作用的OMPs的抗血清对细菌感染的作用不明显。免疫荧光显微镜观察显示，OMP173抗体可以特异性地结合哈氏弧菌。被动免疫结果说明，OMP173抗血清可以明显的降低哈氏弧菌感染诱发的牙鲆死亡率。将FG细胞先与OMP173孵育，后用哈氏弧菌对处理的细胞进行感染，发现侵入细胞的细菌数明显降低。这些结果说明，OMP173和OMP214可以通过特异性抗体的产生来阻碍细菌的侵袭，诱导产生保护性免疫。OMPs的免疫保护性可能与其参与细菌感染有关。
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/17794
专题	实验海洋生物学重点实验室
推荐引用方式 GB/T 7714	于兰萍. 鱼类病原菌的快速诊断与免疫防控[D]. 中国科学院研究生院,2013.

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鱼类病原菌的快速诊断与免疫防控-于兰萍.（3653KB）			限制开放	CC BY-NC-SA	浏览