扇贝耐热性状候选基因的多态性及其作用机制研究

IOCAS-IR > 实验海洋生物学重点实验室

	扇贝耐热性状候选基因的多态性及其作用机制研究
	杨传燕
学位类型	博士
导师	宋林生
	2012-05-22
学位授予单位	中国科学院研究生院
学位专业	海洋生物学
关键词	扇贝基因多态单核苷酸多态性耐热性状分子标记
摘要	扇贝是我国重要的海水养殖品种，但近年来不断爆发的夏季大规模死亡事件严重影响了扇贝养殖业的健康发展。由于高温是造成夏季扇贝死亡的主要环境因素，因此培育耐热性强的优良品种是解决这一问题的有效措施，而寻找与耐热性状相关的分子标记进行标记辅助育种是扇贝耐热品种培育最快捷的途径。本研究从湛江采集海湾扇贝南方亚种（Argopecten irradians concentricu）群体，从秦皇岛采集海湾扇贝北方亚种（Argopecten irradians irradian）群体，分别作为海湾扇贝耐热群体和热敏感群体进行耐热相关遗传分析。利用PCR、直接测序、PCR-RFLP和Bi-PASA PCR等方法，研究了AiHSP70、AiMT1、AiFer和AiTLR8基因启动子区和编码区的多态性及其与海湾扇贝对高温耐受性的关系。利用RT-PCR、Western blot、构建启动子报告基因载体和蛋白原核重组表达等手段探索了海湾扇贝AiHSP70基因启动子区多态和栉孔扇贝CfHSP22基因编码区多态影响扇贝个体耐热表型的分子机制。海湾扇贝AiHSP70基因组序列总长为5622 bp，包括启动子区、5个外显子和4个内含子。共筛选获得8个插入/缺失（I/D）多态性位点和57个单核苷酸多态性（SNP）位点。在启动子区11个多态性位点中，检测发现有6个位点（-1248、-1108、-1107、-999、-894和-204）在热敏感群体及耐热群体中的分布符合Hardy-Weinberg平衡（HWE）；有3个位点（-967、-480、和-83）在热敏感群体中的分布频率符合HWE，而在耐热群体中均偏离HWE；另外两个位点（-408 和-28）在热敏感群体及耐热群体中均偏离HWE。发现8个位点的不同基因型（-1248 AA、-1108 AA、-1107 TT、-999 CC、-967 GG、-480 AC、-408 TT和-83 AG）在耐热群体中的分布频率显著高于在热敏感群体中的频率，表明这些基因型与海湾扇贝对高温的耐受性显著相关。另外3个位点（-894、-204和-28）的不同基因型在两个群体中分布频率差异不显著。对AiHSP70基因启动子区各多态性位点的统计分析表明，各位点之间存在不同程度的连锁不平衡，提示有单体型的存在。对41种频率大于0.01的单体型在耐热群体及热敏感群体中的频率进行分析，发现G-C-A-A-C-T-A-A-C-A-A单体型在耐热群体中的频率显著高于热敏感群体，表明该单体型与海湾扇贝的耐热性显著相关。AiHSP70基因外显子区的32个SNP位点中有13个为非同义突变，选取其中的3个位点（+406、+3734和+3806位点）进行HWE检测后发现，+406和+3806位点的基因型在热敏感群体及耐热群体中的分布偏离HWE，而+3734位点的基因型在两个群体中的分布符合HWE。其中，基因型+406 TT、+3734 AC和+3806 TT在耐热群体中出现的频率显著高于热敏感群体，表明这些基因型与海湾扇贝对高温的耐受性显著相关。海湾扇贝AiMT1基因启动子序列长度为617 bp，共发现16个SNP位点和1个I/D多态性位点。对其中-375和-337位点的分析发现，-375位点各基因型在热敏感群体及耐热群体中的分布均符合HWE；而-337位点的不同基因型在热敏感群体中的分布频率符合HWE，在耐热群体中偏离HWE。-375位点的3种基因型在耐热群体中的分布频率与热敏感群体中的分布频率无显著性差异，与海湾扇贝对高温的耐受性不相关；而-337 AA基因型在耐热群体中出现的频率显著高于热敏感群体，与海湾扇贝对高温的耐受性显著相关。在长度为1371 bp的AiFer基因部分序列中，共发现一个I/D多态性位点和5个SNP位点。对SNP1、SNP3和SNP4与海湾扇贝耐热性的关系进行分析发现，SNP1位点的不同基因型在两个群体中的分布无显著性差异，与海湾扇贝对高温的耐受性不相关。SNP3 GG基因型和SNP4 TG基因型在热敏感群体中的分布频率和在耐热群体中的分布频率之间存在显著性差异，提示AiFer基因的这两个多态性位点与海湾扇贝对高温的耐受性显著相关。在长度为1407 bp的AiTLR8基因部分序列中，共发现6个SNP位点。分析发现基因型SNP1 AA、SNP2 TT、SNP3 TT、SNP4 GG、SNP5 AA和SNP6 TT在耐热群体中的分布频率显著高于在热敏感群体中的分布频率，提示AiTLR8基因的这6个多态性位点位点与海湾扇贝对高温的耐受性显著相关。本研究对AiHSP70基因启动子区的多态性位点影响海湾扇贝耐热表型的分子机理进行了探讨，结果表明，在热胁迫条件下，AiHSP70基因的耐热型启动子能够更加有效地启动内源AiHSP70基因和外源荧光素酶基因的转录表达，与热敏感型启动子之间存在显著性差异，提示AiHSP70基因启动子区的多态性位点通过影响转录活性引起基因转录和表达的改变。对栉孔扇贝CfHSP22基因编码区的+94 A/C多态的作用机理进行研究的结果表明，耐热型CfHSP22基因的原核重组蛋白在体外的分子伴侣活性要稍强于热敏感型CfHSP22基因的原核重组蛋白，但两者之间无显著性差异，提示CfHSP22基因编码区的非同义突变可能通过影响蛋白的结构引起分子伴侣活性的改变，但这个位点的作用很小。以上结果表明，海湾扇贝AiHSP70、AiMT1、AiFer、AiTLR8基因和栉孔扇贝CfHSP22基因的某些多态性位点与海湾扇贝对高温的耐受性显著相关，提示它们可作为与海湾扇贝耐热相关的候选分子标记应用于贝类育种中。研究结果为阐明热胁迫下扇贝的免疫防御机制提供了分子生物学证据，同时为贝类的标记辅助育种提供了参考。
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/17786
专题	实验海洋生物学重点实验室
推荐引用方式 GB/T 7714	杨传燕. 扇贝耐热性状候选基因的多态性及其作用机制研究[D]. 中国科学院研究生院,2012.

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扇贝耐热性状候选基因的多态性及其作用机制（2984KB）			限制开放	CC BY-NC-SA	浏览