扇贝补体相关分子的结构及功能研究

IOCAS-IR > 实验海洋生物学重点实验室

	扇贝补体相关分子的结构及功能研究
	王雷雷
学位类型	博士
导师	宋林生
	2013-05
学位授予单位	中国科学院研究生院
学位专业	海洋生物学
关键词	海湾扇贝栉孔扇贝补体系统免疫识别固有免疫
摘要	补体系统是多细胞有机体内重要的免疫效应系统，在固有免疫防御中发挥重要作用。补体相关分子存在于多个无脊椎动物门类中，并参与了宿主的免疫防御。目前，软体动物补体相关分子以及补体激活途径的研究刚刚起步，亟待深入。本论文采用分子生物学、生物信息学和免疫学等多种技术，对栉孔扇贝（Chlamys farreri）和海湾扇贝（Argopecten irradians）中的含C1q结构域蛋白（AiC1qDC-2，CfC1qDC-1和CfC1qDC-2）、含硫酯蛋白（CfTEP）、C型凝集素（AiCTL-9）以及纤维蛋白原相关蛋白（CfFREP）等补体相关分子进行了结构和功能的研究，探讨了它们在扇贝免疫系统中的作用。利用RACE技术从海湾扇贝中克隆获得了AiC1qDC-2基因的cDNA序列全长，该分子开放阅读框编码的蛋白序列中含有一个gC1q结构域，具有C1qDC蛋白家族典型的由十个β折叠片形成的球形结构以及特征氨基酸残基。RT-PCR检测结果显示AiC1qDC-2的mRNA主要在肝胰腺和性腺中表达，并且在扇贝受到不同微生物刺激后，血细胞中的表达量均显著上升。重组的AiC1qDC-2可结合LPS、PGN、Yeast-glucan和polyI：C等多种PAMPs，并可凝集Escherichia coli、Vibro anguillarum、Bacillus subtilis 和Pichia pastoris等微生物。利用RT-PCR技术检测了栉孔扇贝CfC1qDC-1 mRNA的表达模式，发现LPS，PGN或β-glucan可显著上调血细胞中该分子的表达水平；在扇贝早期胚胎发育过程中该分子的表达量在D型幼虫期开始迅速上升，在眼点幼虫期达到最高。免疫荧光检测显示，CfC1qDC-1蛋白主要存在于扇贝的肝胰腺、鳃、肾和性腺组织中。重组的CfC1qDC-1能够结合LPS、PGN、β-glucan、polyI:C以及人热聚集的IgG分子，并且与IgG的结合能力可以被LPS所阻断。此外，rCfC1qDC-1还能显著增强血细胞对E.coli的吞噬作用。高级结构分析表明CfC1qDC-1 gC1q结构域表面带正电荷氨基酸残基的分布模式与人补体C1q ghB相似。利用RACE技术从栉孔扇贝中克隆获得了CfC1qDC-2基因的cDNA序列全长，该分子的氨基酸序列包含三个典型的gC1q结构域，能够形成与人补体C1q相似的钟型三聚体高级结构。RT-PCR检测显示，CfC1qDC-2的mRNA在肝胰腺中表达量最高，在扇贝早期胚胎发育到D型幼虫时表达量开始显著上升，在眼点幼虫期达到最高表达水平；当扇贝受到LPS、PGN或β-glucan刺激后，血细胞中该分子mRNA的表达水平显著上升。重组的CfC1qDC-2具有广谱的配体结合谱，可结合6种不同类型PAMPs、8种微生物、扇贝凋亡细胞以及人热聚集IgG和IgM分子，并能抑制兔血清C1q依赖的溶血活性。利用RACE技术从海湾扇贝中克隆获得了AiCTL-9基因的cDNA序列全长，该分子所编码的氨基酸序列包含四个CTLD结构域，具有C型凝集素家族典型的结构和特征基序。RT-PCR检测显示，AiCTL-9的mRNA在肝胰腺和性腺中表达量较高，并且当扇贝受到不同微生物刺激后，血细胞中的表达量均显著上升。重组的AiCTL-9可结合LPS、β-glucan、MAN等多种PAMPs，凝集E. coli、V. angulillarum、B. subtili和Micrococcus buteus等微生物，还能显著增强血细胞的包囊化作用。利用同源克隆技术从栉孔扇贝中克隆获得了CfFREP基因的cDNA序列全长，该分子的氨基酸序列包含一个FBG结构域，具有FREP家族典型的结构和特征序列。RT-PCR检测结果显示，当扇贝受到LPS或PGN刺激后，血细胞中CfFREP mRNA的表达量均显著上升。免疫荧光显示CfFREP蛋白主要存在于扇贝的肝胰腺，鳃，肾以及血细胞周围。重组的CfFREP可结合LPS、PGN、β-glucan和polyI:C，但无凝菌活性。利用RT-PCR技术对栉孔扇贝CfTEP mRNA的检测结果显示，当扇贝受到LPS、PGN或β-glucan刺激后，血细胞中该分子的表达量均显著上升；在扇贝早期胚胎发育过程中，该分子的表达量从D型幼虫期开始显著上升，在眼点幼虫期达到最高。免疫荧光表明CfTEP蛋白主要分布于扇贝肝胰腺、鳃、肾、性腺和外套膜中，并且在D型幼虫、面盘幼虫和眼点幼虫外围也均有分布。Western blotting显示CfTEP蛋白在扇贝血清中以断裂的片段形式存在，并且当注射甲胺使体内TEP失活后，扇贝在V. angulillarum侵染后的存活率明显下降。对以上六个扇贝补体相关分子的研究表明，它们与高等动物补体分子C1q、C3、ficolin或MBL在结构上存在相似，并具有高等动物补体分子类似的功能，可作为模式识别受体参与免疫识别，抑或作为效应分子参与病原清除，同时，具有结合高等动物免疫球蛋白和扇贝凋亡细胞的能力。该研究结果表明补体相关分子可能作为原始补体系统的组分参与扇贝的固有免疫防御，为阐明补体相关分子的进化脉络以及丰富和发展海洋无脊椎动物免疫学内容提供了分子生物学证据。
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/17779
专题	实验海洋生物学重点实验室
推荐引用方式 GB/T 7714	王雷雷. 扇贝补体相关分子的结构及功能研究[D]. 中国科学院研究生院,2013.

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扇贝补体相关分子的结构及功能研究-王雷雷（6862KB）			限制开放	CC BY-NC-SA	浏览