| 摘要 | 皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）原产于中国北部辽东和胶东半岛近岸，是我国重要的海水养殖贝类。目前，我国皱纹盘鲍人工养殖区域已向南扩展至福建和广东等省。皱纹盘鲍人工养殖区域广、密度高，近年来，虽然种质和养殖技术均已有较大提升，但养殖管理和疾病预防仍相对落后，还缺乏有效措施防止在养殖过程中暴发病害。2011和2012年，福建和广东两省近海养殖的皱纹盘鲍发生病害，面积大、持续时间长。于2011年12月初从广东汕头市南弘海珍养殖有限公司取皱纹盘鲍2月龄幼鲍，从中分离到两株致病弧菌，分别命名为bb3和bb4。为明确这两株弧菌与中国南海养殖区皱纹盘鲍病害的关系，进行如下实验：两株弧菌的形态观察和分类鉴定、两株弧菌的适宜生长温度范围和药敏试验、弧菌对1龄皱纹盘鲍的致死效应分析、环境因子对两株弧菌致死效应分析的影响、菌株bb4胁迫对皱纹盘鲍相关免疫物质表达的影响，现将阶段性结果总结如下： 1 菌株bb3和bb4的形态观察和分类鉴定 两株弧菌在LB培养基上均呈淡黄色，菌落圆形、表面光滑、中央隆起、边缘整齐，相同培养条件下，菌株bb3的菌落体积略大于bb4。通过革兰氏染色观察，菌株bb3和bb4均为革兰氏阴性菌；经透射电镜负染观察知两者均为杆状，菌株bb3无鞭毛而bb4则含一根鞭毛。 通过16S rRNA序列分析知菌株bb3和bb4均为弧菌，且初步确定bb3为溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus），其最大序列相似度为99%；bb4为哈氏弧菌（V. harveyi），最大序列相似度为100%。进一步测定菌株bb3和bb4的5个管家基因(topA, ftsZ, gapA, mreB, gyrB)序列，经以上五个管家基因的MLSA综合分析法确定bb3和bb4分别是溶藻弧菌（V. alginolyticus）和哈氏弧菌（V. harveyi）。 2 菌株bb3和bb4的适宜生长温度及对常见抗生素的敏感性分析 通过稀释平板计数法，对菌悬液进行计数，测得1OD bb3: 12.4×108cfu/ml，bb4: 10×108cfu/ml；菌株bb3和bb4在不同培养温度下的生长速度呈单峰曲线，最适生长温度为32℃，在20~32℃范围内，生长速度随培养温度升高而加快，在32~36℃之间则随培养温度进一步升高而下降；药敏试验结果表明，菌株bb3对20种抗生素中的12种药物敏感，菌株bb4则对其中10种敏感，2株弧菌均敏感的抗生素仅有头孢曲松和丁胺卡那霉素，说明菌株bb3和bb4对抗生素已产生一定程度的耐药性。 3 菌株bb3和bb4对1龄皱纹盘鲍的致死效应分析 用倍比稀释法将bb3和bb4分别稀释成不同浓度的悬浮液，取1龄皱纹盘鲍（壳长：3.12±0.14 cm，全湿重：4.01±0.54g）作为受试动物，采取肌肉注射方式，每一个体注射100μl弧菌悬浮液，对照组注射相同体积的磷酸盐缓冲液PBS。弧菌注射感染皱纹盘鲍后，将鲍放在24℃条件下流水培养2周，期间每天统计各处理组的死亡情况。结果表明：（1）18h皱纹盘鲍开始出现死亡，死亡高峰发生在第3天；（2）注射处理后2周，对照组皱纹盘鲍平均累积死亡率仅为2.22%；（3）浓度5×104, 5×105, 5×106, 5×107, 5×108cfu/ml bb3注射处理后，各处理组鲍平均累积死亡率分别为15.56, 31.33, 58.00, 85.56和100.00%，bb3注射处理的半数致死量（LD50）是1.94×106cfu/ml；（4）浓度5×104, 5×105, 5×106, 5×107 bb4注射处理后，则各处理组鲍平均累积死亡率分别为38.67, 70.00, 95.56和98.89%，菌株bb4的LD50是1.11×105 cfu/ml。上述结果表明，受试皱纹盘鲍死亡率与注射的菌液浓度成正比，菌株bb4的致死效应强于bb3。 4 温度、盐度等环境因子对菌株bb3和bb4致死效应分析的影响 为研究温度和盐度等环境因素对弧菌bb3和bb4致死效应的影响，菌株bb3（2.5×107cfu/ml）、bb4 (2×107cfu/ml) 和PBS（对照组）悬浮液肌肉注射皱纹盘鲍后，将受试皱纹盘鲍分别置于不同温度（12, 16, 18, 20, 24, 28℃）或不同盐度（24, 26, 28, 30‰）海水中培育，每日观察统计各处理组鲍的死亡情况。实验结果显示随温度升高皱纹盘鲍累积死亡率增加，盐度降低至24‰时三组处理皱纹盘鲍的累积死亡率均为最高，因此高温和低盐均增加鲍病害发生的概率。 5 菌株bb4胁迫对皱纹盘鲍免疫相关物质表达的影响 菌株bb4感染皱纹盘鲍后，鲍相关免疫因子C型溶菌酶（Lys）基因和血蓝蛋白含量均发生显著变化。通过实时荧光定量PCR分析，组织特异性实验结果显示：Lys在外套膜中相对表达含量最高，其次是鳃、消化腺，在腹足、血细胞中几乎不表达；菌株bb4感染后，Lys相对表达含量呈先升高后恢复至起始水平的趋势，在6h时Lys相对表达含量达到最高（空白组的6.24倍）且与0h组差异显著。菌株bb4感染皱纹盘鲍后，随时间变化鲍血蓝蛋白含量呈下降趋势，至48h时降至最低点，且36和48h时血蓝蛋白含量均与0h血蓝蛋白含量相比差异显著，在48h后，血蓝蛋白含量开始逐渐恢复至起始水平。 |
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