两种产卡拉胶红藻原生质体制备与枝段培养

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	两种产卡拉胶红藻原生质体制备与枝段培养
	李俊鹏
学位类型	硕士
导师	刘建国
	2013-05
学位授予单位	中国科学院研究生院
学位专业	海洋生物学
关键词	长心卡帕藻细齿麒麟菜篮子鱼原生质体组织培养
摘要	长心卡帕藻（Kappaphycus alvarezii）和细齿麒麟菜（Eucheuma denticulatum）是工业上生产卡拉胶的重要原料，也可作为生产工业乙醇的原料。此类海藻具有巨大市场需求和开发价值，目前产卡拉胶红藻养殖产业还相对落后，以野生种质通过营养繁殖的方式进行栽培。苗种长期营养繁殖已造成严重的种质退化，生长变慢、胶含量和强度减少和抗病能力变弱等，近年来已经对在我国该产业发展造成很大损害。为此，有必要深入探讨此类海藻保苗和育种工作，维持产卡拉胶红藻产业长期稳定发展。基于该藻无性生殖难以发现，而无性繁殖又严重退化，本文从组织培养和原生质体制备角度开展工作，目的为进一步探讨细胞融合与杂交等工作，最终开展长心卡帕藻和细齿麒麟菜人工保苗和育种新途径提供基础数据和技术方法；同时，针对目前该海菜在长途运输过程中易于失活问题，开展了相关鲜活材料保存技术研究，为这类海藻产业可持续发展提供基础支撑技术。主要工作进展如下：1) 可利用纤维素酶和果胶酶组合酶液酶解长心卡帕藻和细齿麒麟菜，得到游离细胞和极少数原生质体。在30℃、pH 6.0和0.4 g藻泥+3 ml酶液条件下酶解48 h，可获得长心卡帕藻和细齿麒麟菜最大游离细胞产量，其产量分别为6.48 ? 106 Cell和6.80 ? 106 Cell；而最高游离细胞产率的酶解条件为：30℃、pH 6.0和0.1 g藻泥+3 ml酶液条件下酶解48 h，在此条件下，长心卡帕藻和细齿麒麟菜游离细胞产率分别为1.70 ? 107 Cell?g-1和1.62 ? 107 Cell?g-1。同时，在酶含量一定时，藻泥用量越多可获得的游离细胞产量越多，但其产率下降；在20-30℃酶解温度梯度内，游离细胞产量随温度升高而增加；酶解pH实验结果表明，pH6.0的弱酸性环境更有利于游离细胞产生，pH7.0和8.0时酶解效率有一定程度下降；12-24 h的酶解时间梯度实验表明，游离细胞产量随酶解时间的延长而增加。2) 实验表明，利用篮子鱼内脏制备消化酶液，可酶解制备长心卡帕藻和细齿麒麟菜原生质体，原生质体通过细胞培养的方法可以获得愈伤组织，通过PEG诱导融合的方法可以产生融合细胞。其中25℃、pH 6.0和0.4 g藻泥+3 ml酶液，酶解48 h条件下，细齿麒麟菜原生质体产量最大，为4.15 ? 103 Cells，而上述条件也最有利于获得长心卡帕藻原生质体，其最大产量为3.8 ? 103 Cells。为得到最高原生质体产率，可选择的酶解条件：25℃、pH 6.0、0.1 g藻泥+3 ml酶液条件下酶解48 h，在此酶解条件下，细齿麒麟菜原生质体得率高于长心卡帕藻，其中细齿麒麟菜原生质体最高产率达到1.75 ? 104 Cells? g-1，而长心卡帕藻的最高原生质体产率为1.45 ? 104 Cells?g-1；藻泥与酶浓度配比实验表明，长心卡帕藻或细齿麒麟菜藻泥越多所制备出的原生质体产量越多，但其制备效率却越低；酶解温度（20-30℃）梯度实验表明其最高原生质体产量和效率的酶解温度为25℃，在在pH 6.0-8.0的酶解梯度中，酶解pH 6.0时酶解效果最好；在12-48 h酶解时间梯度内，酶解时间越长，长心卡帕藻或细齿麒麟菜原生质体制备效率越高，即酶解48 h时原生质体产量和得率最高。3) 通过组织培养，可诱导长心卡帕藻和细齿麒麟菜藻段产生新愈伤苗。在三种实验的海水培养基（F/2、PES和ESS）中，长心卡帕藻和细齿麒麟菜在PES培养基中的组织培养存活率最高；在植物生长调节物质添加试验中，1 mg/L 萘乙酸和0.5 mg/L玉米素处理组的藻段存活率，明显高于1 mg/L生长素和0.5 mg/L玉米素处理组，也高于未添加激素对照组；在50-200 μmol m-2s-1光照强度梯度实验表明，光照100 μmol m-2 s-1条件下长心卡帕藻和细齿麒麟菜的存活率最高；对比水平、竖直和纵切水平放置方式的培养结果表明，横切水平放置的长心卡帕藻和细齿麒麟菜存活率最高。4) 系列鲜活材料的离水保活实验表明，可保存长心卡帕藻和细齿麒麟菜活性的最长时间为5天，保存这类热带产胶海菜活性最高的最佳条件为温度17-20℃、相对湿度70-100%和避免光照的黑暗条件。
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/17706
专题	海洋生物技术研发中心
推荐引用方式 GB/T 7714	李俊鹏. 两种产卡拉胶红藻原生质体制备与枝段培养[D]. 中国科学院研究生院,2013.

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