海洋生态与环境科学重点实验室知识库

甲藻是引起有害藻华的主要种类（75%以上藻华事件由甲藻引起），但长期以来对甲藻营养生态学的研究主要集中于常见的无机营养盐如氮和磷等，很少关注微量营养元素如维生素。但是实际上90%以上的甲藻都是维生素B₁₂的营养依赖型(auxotrophs)。故探索甲藻对维生素B₁₂依赖性营养的遗传学基础对甲藻生物学及其有害藻华生态学具有重要意义。已有研究证明某些藻类对维生素B₁₂的依赖性营养主要取决于二种甲硫氨酸合成酶基因的有无：以B₁₂为辅酶的METH基因和不以B₁₂为辅酶的METE基因。为了揭示甲藻维生素B₁₂依赖性营养的遗传学基础，本研究使用cDNA末端快速扩增技术（RACE）获得14种甲藻的相关基因全长，并结合实时荧光定量PCR技术比较其中10种甲藻的METH与METE基因在不同维生素B₁₂浓度和添加方式下的表达模式，对其基因功能进行判断。通过整理分析已公开的甲藻转录组和基因组信息，建立甲藻cDNA文库，以获得的14种甲藻的甲硫氨酸合成酶基因METH与METE的cDNA全长为基础比对获得共61种甲藻的METH与METE基因信息并进行系统进化分析，明确地解释了甲藻维生素B₁₂依赖性营养在基因水平的原因，从而确认了甲藻维生素B₁₂依赖性营养的分子机理。主要实验结果简述如下：

（1）14种甲藻的METH和METE基因全长克隆

对实验室培养的14种甲藻的共38个METH和METE基因进行了全长克隆，发现所有14种甲藻均具有完整的METH，且与其它模式生物的METH功能域一致，但只有12种甲藻存在METE，且无证据表明另外2种甲藻存在METE。使用CD-search进行功能域预测发现，存在于该12种甲藻的所有METE功能域均不完整，即缺少N端结构域，因此推测它们可能不能行使甲硫氨酸合成的功能。

（2）甲藻的维生素B₁₂依赖性营养的证明

通过维生素B₁₂营养限制和再添加实验以及直接供给甲硫氨酸的生理实验，发现8种甲藻的生长取决于维生素B₁₂的有无，添加维生素B₁₂可以使受营养限制的甲藻恢复生长，再次确认了8种甲藻对维生素B₁₂的依赖性营养，并且不能靠添加甲硫氨酸缓解维生素B₁₂不足导致的生长限制。

（3）甲藻METH、METE基因表达与维生素B₁₂浓度的响应关系

根据10种甲藻的生理实验结果和qRT-PCR实验结果，METH和METE基因对B₁₂浓度响应的表达模式可总结如下：在受到低浓度维生素B₁₂营养限制后，METH的表达量与维生素B₁₂浓度存在负反馈调节机制，即当受到低浓度维生素B₁₂限制时，METH的表达量上升，但恢复维生素B₁₂浓度后METH表达量下降；METE基因在维生素B₁₂充足时表达未表现出明显下调，但在低浓度维生素B₁₂限制时也没有出现高表达（即代替METH行使甲硫氨酸合成功能），而且在恢复维生素B₁₂至正常培养基浓度后也未见明显抑制或下调。通过与其它兼具METH和METE两个基因且有完整功能的物种相比，本研究中所有甲藻METE基因表达与维生素B₁₂浓度的响应关系佐证了该基因在甲藻中因功能域不完整无法行使功能的推断。

（4）甲藻METE基因功能初探

以剧毒卡尔藻（Karlodinium veneficum）为实验对象，通过qRT-PCR发现METH和METE基因在生长周期和培养的光暗周期不同阶段的表达如下：随着甲藻进入指数生长期，METH和METE基因表达量逐渐下降；METH和METE基因在无光照时表达量较高，在有光照时表达量下降。METE呈现的在生长周期和昼夜周期不同阶段的表达动态说明其可能参与了甲藻的其它生化过程，特别是与细胞增殖有关的反应。

（5）甲藻和非甲藻METH和METE基因的系统进化分析

基于构建的甲藻cDNA文库，以获得的14种甲藻的METH与METE基因为基础进行比对检索，确认了目前可获得的绝大多数甲藻物种的METH和METE基因信息。在整理分析的共61种甲藻中，所有甲藻均含有METH基因且功能域完整。通过与其它物种的METH基因进行系统进化分析，构建的系统进化树不仅较好地反映了物种间的分类学亲缘关系，并且甲藻METH基因的功能与其它物种特别是METH基因功能已被确认的种类相同。而在所有61种甲藻cDNA文库中只有43种甲藻中可以比对获得METE基因（其余18种甲藻未发现），并且所有获得的METE基因其功能域均不完整，无N端结构域。通过与来自其它门类物种已证明具有甲硫氨酸合成功能的METE基因进行系统进化分析并构建系统进化树表明，所有种类的METE基因根据功能域的完整与否在进化树上形成不同分枝，证明甲藻中存在的METE基因因功能域不完整无法完成甲硫氨酸合成，从而在基因结构水平解释了绝大多数甚至全部甲藻对维生素B₁₂的依赖性营养。

基于上述实验结果，我们从基因水平上完整地解释了绝大多数受试甲藻都是维生素B₁₂的营养依赖型的遗传学基础，即因为缺少METE或者METE基因功能域不完整使得甲藻必须依赖以维生素B₁₂为辅酶的METH合成甲硫氨酸。我们据此提出假说认为所有的甲藻都是维生素B₁₂营养依赖型。了解甲藻维生素B₁₂依赖性营养的遗传学基础和分子机理，很大程度地深化了我们对维生素B₁₂及其依赖性营养在藻华特别是甲藻藻华发生中重要作用的认识，从而将为进一步探索有害藻华爆发机理和防控原理提供基础性依据。

上述主要研究之外，本学位论文还包括对一种常见的有害藻华甲藻褐色马格里夫藻（Margalefidinium fulvescens）的中国胶州湾种群的种内遗传多样性研究。核糖体大亚基DNA（LSU rDNA）序列被越来越多地用于推断各类物种的系统发育关系和物种鉴定，因为相较于rDNA的其它亚基LSU rDNA含有一个高可变的D2区而更适合于鉴别近亲种或鉴别种内遗传变异。早前的研究中发现某些甲藻存在较高的种内遗传多样性，甚至是个体内（即单细胞内）的遗传多样性。一般认为这种遗传多样性的原因是甲藻基因组内rDNA基因具有很高拷贝数导致。但是，rDNA的拷贝数在甲藻物种之间存在巨大差异，因此需要对每一重要物种的种内遗传多样性进行单独研究。褐色马格里夫藻是一种产毒的常见有害藻华甲藻，在美国、加拿大、韩国等多个海域多次发生藻华且造成鱼类死亡事件。自2015年以来，本课题组在中国胶州湾几次发现其已接近藻华细胞密度。为了更好对这一中国海域新发现的藻华原因种进行常规监测、分析其与世界其它种群的亲缘关系和追溯其可能的来源，本研究分别对野外接近藻华密度样品和通过单细胞分离建立的实验室纯培养进行了LSU rDNA测序和系统遗传学分析，发现褐色马格里夫藻胶州湾种群在种群内和个体内均存在较高遗传多样性。本研究对7个野外样品和11个分离的单细胞纯培养构建序列文库，扩增LSU rDNA的D1–D6区序列（1435个碱基），经过克隆测序共获得的2341条序列，并对其进行系统遗传学分析。在获得的所有序列中，只有一条在所有样品中均被检测出，该序列被认为是该物种大量rDNA拷贝中丰度最高从而具有代表性的序列。本研究发现褐色马格里夫藻相较其它研究过的甲藻物种（如红色赤潮藻Akashiwo sanguinea和链状亚历山大藻Alexandrium catenella），其LSU rDNA存在更高的种群内和个体内的遗传多样性，序列具有更多的多样性位点数量和更高的序列多样性。不同野外样品和不同单细胞纯培养内每条序列之间的平均核苷酸差异分别为6.43个碱基和4.42个碱基，其中与该物种参考序列差异最大的序列存在132个碱基差异，序列相似度仅90%。而以往环境基因组研究（或称宏基因组、DNA宏条形码）中被注释为相同物种的序列相似度判断阈值通常需达到97%以上。由于7个野外样品和11个纯培养样品之间整体的遗传多样性程度相当，结合分子方差分析（AMOVA）的结果，可以判断褐色马格里夫藻单细胞内的rDNA拷贝间的多样性导致了个体内遗传多样性并进一步导致了种群内的遗传多样性。因此不同地理种群间可能存在更高的种群间多样性。本工作为未来对该藻华原因种不同地理种群间的全面比较提供了数据和理论基础，并对以基于数据库中参考序列间比较为主要方式的甲藻物种鉴定和建立新的甲藻分类群都具有重要的意义。