实验海洋生物学重点实验室知识库

随着铜在农药中的广泛应用，铜杀菌剂经历了无机铜、合成有机铜和天然有机铜三个发展阶段。随着人们对食品安全和环境友好的要求不断提高，高效低毒的天然基质铜是未来农药的发展趋势。目前铜制剂的抗菌机制研究主要集中在细菌，而抗真菌尤其是卵菌机制尚不清楚。本实验室以甲壳素/壳聚糖（CS）为基质，合成了一种天然有机铜制剂—壳聚糖烟酰胺席夫碱铜配合物（O-CSLn-Cu），并以辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leonian）为研究对象，采用串联质谱（TMT）蛋白质组学和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）非靶向代谢组学相结合的方法，从蛋白质组的调控通路分析，到代谢组的调控通路验证，最终以联合分析与表型验证相结合的方式，逐步推理出O-CSLn-Cu对P. capsici Leonian的抑真菌机制。该研究不仅为大分子杀菌剂的抑菌机制研究提供新思路，也为该有机铜制剂的产业应用奠定了理论基础。

本文深入研究了O-CSLn-Cu对P. capsici Leonian的抑真菌机制，获得主要结果如下：

1. 首先合成O-CSLn-Cu并表征，然后测定O-CSLn-Cu抑P. capsici Leonian 活性，最后利用蛋白组学筛选O-CSLn-Cu作用前后菌体蛋白水平的差异通路，探讨O-CSLn-Cu作用方式。红外光谱结果显示O-CSLn-Cu金属配合物合成成功；抑菌实验测定的O-CSLn-Cu抑制P. capsici Leonian的药物半抑制浓度为0.15 mg/mL，最佳处理时间为12 h；TMT定量蛋白质组学分析结果中共鉴定到5021个蛋白质，其中包括1172个差异蛋白质。KEGG通路富集结果显示氨基酸代谢，丙酸代谢，丙酮酸代谢，乙醛酸和二羧酸代谢，甘油脂代谢以及谷胱甘肽代谢途径变化显著。GO 功能富集的结果表明，在生物学过程和分子功能中，Acetyl-CoA相关代谢变化显著；在细胞组分中，质膜与内膜等定位蛋白同样发生了显著性变化。
2. 利用代谢组学进一步测定O-CSLn-Cu作用前后菌体的差异代谢物。利用超高效液相串联四极杆飞行时间二级质谱技术鉴定到93个差异代谢物。KEGG通路富集结果显示乙醛酸和二元酸代谢、TCA循环、蛋白质消化和吸收、氨基酸代谢以及嘌呤代谢代谢途径变化显著，且与蛋白质组的差异代谢通路密切相关。代谢物分类结果显示：40%的差异代谢物属于有机酸及其衍生物，而其中大部分都是氨基酸、肽及其类似物。代谢产物亚细胞定位结果表明：大部分差异代谢物分布在细胞质、线粒体、细胞膜及细胞器膜上。其中线粒体包含了柠檬酸在内的32种差异代谢物，是含差异代谢产物最多的细胞器。
3. 运用蛋白质组学与代谢组学联合分析，筛选O-CSLn-Cu对P. capsici Leonian作用后的主要差异代谢通路。联合分析结果显示，与能量相关的代谢途径变化显著，透射电子显微镜（TEM）观察到线粒体内膜消失。进一步利用生化实验验证组学的分析结果，酶活性测定结果表明糖酵解限速酶磷酸果糖激酶活性升高，TCA循环中的α酮戊二酸脱氢酶活性下降，代谢物检测发现柠檬酸水平显著下降，说明O-CSLn-Cu可引起线粒体损伤，诱导P. capsici Leonian 产生“华宝效应”（“Warburg effect”），即线粒体呼吸链功能不全，细胞质中糖酵解速率增加。同时代谢物检测发现ATP水平显著下降，说明胞内能量供应不足，外源添加ATP可降低O-CSLn-Cu的抑菌率，但不能达到100%缓解率。此外，二氯荧光素实验显示菌体内活性氧（ROS）大量积累，推测线粒体损伤与ROS积累可能形成恶性循环，导致菌体死亡。因此线粒体可能是O-CSLn-Cu抗真菌作用的重要靶点。
4. 为进一步探究O-CSLn-Cu上游的抑菌过程，首先设计合成了荧光素标记的壳聚糖席夫碱铜配合物（FITC-O-CSLn-Cu）并表征，然后对FITC-O-CSLn-Cu进行细胞定位，最后结合组学分析和生化实验探究菌体功能受损情况。红外光谱结果显示FITC-O-CSLn-Cu金属配合物合成成功；利用激光扫描共聚焦显微镜观察到FITC-O-CSLn-Cu可进入胞内，TEM结果显示O-CSLn-Cu破坏了细胞膜结构，使细胞膜出现非正常的“间隙泡”结构；差异蛋白质和代谢物亚细胞定位发现，大部分显著性差异的候选物呈下调趋势，稳定细胞渗透压的关键蛋白—水离子通道蛋白10（PcAqp10）显著下调倍数最大。细胞膜荧光强度检测结果表明O-CSLn-Cu破坏细胞膜蛋白质成分；体内丙二醛含量检测及体外囊泡实验说明O-CSLn-Cu破坏脂质成分。细胞渗透检测结果显示，O-CSLn-Cu引起菌体电导率增大，蛋白质和糖类外泄增加；TMA-DPH实验表明O-CSLn-Cu导致细胞膜流动性下降；实时荧光定量PCR实验显示O-CSLn-Cu处理组的 PcAqp10的mRNA显著下调。以上结果说明O-CSLn-Cu可损伤细胞膜结构，影响P. capsici Leonian细胞膜众多生理功能。PcAqp10可能是O-CSLn-Cu抑菌过程中，膜上的重要分子靶标。

综上，本研究利用蛋白质组学和代谢组学探究了P. capsici Leonian在O-CSLn-Cu作用下的分子反应。结合多角度的抑菌靶标分析及验证，发现O-CSLn-Cu能够破坏菌丝形态，损伤细胞膜结构和功能，降低细胞膜选择透过性和流动性；同时进入胞内引起线粒体损伤，降低线粒体能量代谢效率，进而影响ATP水平，最终导致P. capsici Leonian死亡。因此O-CSLn-Cu是一个多靶标，高效率的抗真菌剂。