实验海洋生物学重点实验室知识库

    本研究以凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）为对象，选取对虾养殖生产中较为突出的三种不同致病因素——黄曲霉毒B1（AFB1）、高密度养殖、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）作为胁迫因子，分别对健康的凡纳滨对虾进行胁迫实验，研究不同致病因素对凡纳滨对虾生长、抗氧化、免疫以及营养性能的影响，并结合转录组和微生物16S测序技术系统地研究了对虾肝胰腺和肠道对不同致病因子的潜在响应机制及其关联性。

1、凡纳滨对虾肝胰腺和肠道对投喂AFB1响应机制的研究

   实验选取体质健康的凡纳滨对虾（初始体重为2.55 ± 0.08 g）为研究对象，分别投喂含有 5 p.p.m.（实验组）和含有0 p.p.m.（对照组）AFB1的饲料，进行周期30天的养殖实验。分别在第3、6、12、18、24和30天进行生长指标测定，并收集肝胰腺和肠道样品进行研究。结果如下：实验组对虾的存活率和体重增率显著低于对照组（P < 0.05），且肝胰腺和肠道显微结构破坏严重；实验组肝胰腺和肠道消化酶活性和基因表达水平显著低于对照组（P < 0.05），且随着养殖时间延长不断降低；实验组肝胰腺和肠道超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性显著高于对照组（P < 0.05），且呈先升高后降低的趋势；实验组中肝胰腺和肠道中的免疫基因（Toll、IMD、proPO、Rab、GST）均显著高于对照组（P < 0.05），总体上呈现先升高后显著降低的趋势；转录组测序结果表明，在实验组肝胰腺和肠道中分别鉴定了12,410和1,387个差异表达基因（DEGs），在肝胰腺中有1,995个DEGs被注释，其中有18条与免疫相关的通路或过程。在肠道中有152 DEGs被注释，其中有7条与免疫相关的通路或过程；肠道微生物16S测序结果表明，随着实验天数的延长，实验组中变形杆菌门（Proteobacteri）、厚壁菌门（Firmicutes）、弧菌属（Vibrio）和发光细菌属（Photobacterium）的相对丰度明显增加，拟杆菌门（Bacteroidetes）和黄杆菌属（Flavobacterium_sp_M、Tenacibaculum）的相对丰度下降，且对照组的菌群数量和种类均比实验组丰富。以上结果说明，投喂含有5 p.p.m. AFB1的饲料会诱导凡纳滨对虾抗氧化和免疫系统损伤、造成肠道菌群组成紊乱（有益菌减少，有害菌增加）、消化系统抑制、组织结构损伤，从而导致对虾生长受到阻碍、死亡率升高。另外，相比于肠道，肝胰腺是响应AFB1感染的主要免疫器官，而肠道起了重要的代谢作用。

2、凡纳滨对虾肝胰腺和肠道对高密度养殖以及在高密度条件下对副溶血弧菌E1（VPE1）感染响应机制的研究

   实验选取体质健康的凡纳滨对虾（初始体重为7.52 ± 0.12 g）为研究对象，将其分为高密度组（800尾/m³）和低密度组（400尾/m³）进行周期15天的养殖实验，然后，使用副溶血弧菌E1（VPE1）分别对高密度组和低密度组的凡纳滨对虾进行周期为72小时的感染实验，分别在不同密度养殖实验的第5、10和15天以及攻毒实验的第12、24、48和72小时进行生长指标测定，并收集肝胰腺和肠道样品进行研究。实验结果如下：高密度组对虾存活率和体重得率显著低于低密度组（P < 0.05），且肝胰腺和肠道组织显微结构出现明显损伤；高密度组对虾肝胰腺和肠道消化酶活性和基因表达水平显著低于低密度组（P < 0.05），且随着实验时间延长不断降低；高密度组对虾肝胰腺和肠道中T-SOD、CAT和GPX活性显著低于低密度组（P < 0.05），总体上呈先升高后降低的趋势；在不同密度养殖实验的第15天，高密度组对虾肝胰腺和肠道中免疫基因（Toll、IMD、ProPO、LZM、Relish）的表达量均显著高于低密度组（P < 0.05），VPE1感染后，呈先升高后降低的趋势；转录组测序结果表明，在不同密度养殖实验的第15天，在高密度组对虾肝胰腺中共鉴定了45个DEGs，并富集到4条与免疫相关的通路或过程，而在肠道中鉴定了5,470个DEGs，并富集到17条与免疫相关的通路或过程；VPE1感染第48小时，在高密度组对虾肝胰腺中鉴定了639个DEGs，富集到免疫相关通路或过程14条，在肠道中鉴定了279个DEGs，富集到免疫相关通路或过程5条；微生物16S测序结果表明，在不同密度养殖的第15天，高密度组对虾肠道中拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、假替单胞菌属（Pseudoalteromonas）和Blastopirellula的相对丰度降低，浮门菌门（Planctomycete）、发光细菌属（Photobacterium）和弧菌属（Vibrio）的相对丰度增加。以上结果表明，高密度养殖（800 尾/m³）会抑制凡纳滨对虾的生长、破坏肝胰腺和肠道组织形态结构、损伤免疫和抗氧化系统，进而导致其抵御副溶血弧菌侵染的能力下降，最后由于疾病感染造成更高的死亡率；同时高密度养殖不仅导致对虾肝胰腺和肠道大量差异基因表达，还造成肠道有益菌群的种类和数量减少，有害菌群增加。另外，相比于肝胰腺，肠道对密度胁迫更为敏感。

3、凡纳滨对虾肝胰腺和肠道对VPE1感染响应机制的研究

   实验选取体质健康的凡纳滨对虾（初始体重为12.28 ± 0.10 g）为研究对象，将其分为VPE1感染组（实验组）和对照组进行周期为3天的攻毒实验，并收集了攻毒后第48小时的肝胰腺和肠道样品进行了转录组测序。结果如下：实验组对虾的死亡率要显著高于对照组（P < 0.05），同时，VPE1感染导致对虾肝胰腺产生2,628个DEGs，其中有2,489个基因显著上调，139个基因显著下调，总共富集到27条免疫相关通路或过程；同时，在肠道中鉴定了1,963个DEGs，其中有1,732个基因表达显著上调，231个基因显著下调，总共富集到27条免疫相关通路或过程。以上结果表明，感染VPE1会诱导对虾肝胰腺和肠道大量差异基因表达，进而引起肝胰腺和肠道免疫相关通路紊乱，最终导致其死亡率升高。另外，相比于肠道，肝胰腺是响应VPE1感染的主要免疫器官。

4、凡纳滨对虾肝胰腺与肠道免疫响应不同致病因素潜在关联性的初步探究

   本研究利用转录组和生物信息学技术，分别对AFB1、密度胁迫和VPE1三种不同致病因子所引起的凡纳滨对虾肝胰腺和肠道在转录水平上的差异和联系进行了整合分析，结果表明：以上三种致病因子条件下对虾肝胰腺和肠道中差异基因所富集到的共有的GO功能条目有7条，而共有的KEGG通路有18条，其中有5条与免疫相关，包括凋亡、吞噬、AMPK信号转导、抗原处理及呈递和EB病毒感染。因此推测，这些通路可能是肝胰腺与肠道在免疫防御功能上具有潜在关联性的通路或过程。