实验海洋生物学重点实验室知识库

工业化循环水养殖产业的蓬勃发展伴随着养殖负荷的增加，养殖水质不稳定，养殖鱼体长期处于各种因素导致的慢性胁迫中，对病原生物的抵抗力变弱，从而使大范围的急性病害频繁出现，成为降低产业利润的重要因素之一。抗生素是近几十年养殖产业中抑制病原最有效的方法，但其应用陆续被证明有很多负面效果，它能导致生物出现抗药性，同时它能通过食物链作用进入人体，影响人类健康。因此，开发环保并且健康的治疗病害方法，降低养殖业损失是全球范围内科研人员重要研究方向。近年来研究表明，免疫增强剂可以积极有效的增强水生生物免疫功能，帮助动物抵抗外来病原体的感染。目前，科研人员对多种免疫增强剂的候选物质进行过科学验证，但是只有少数物质既能提高动物免疫又对环境友好，是水生生物免疫增强剂的理想选择。

这些理想的免疫增强剂中，β-葡聚糖在人类和哺乳动物中研究深入且应用广泛，它能参与调控生物体的免疫力、缓解应激引发的内环境失衡、具有抗癌功能，因此本文选取β-葡聚糖为研究对象，研究其对虹鳟生长、抗杀鲑气单胞菌感染以及其作用机制。同时，本文还研究了它对肠道炎症的保护作用以及保护机制，以期为水产养殖动物病害的预防提供了经济、绿色、无污染的方法，也为β-葡聚糖在鱼类养殖中的推广提供理论依据和技术支持。本研究的主要结果如下：

1. 饲料中添加β-葡聚糖能促进虹鳟的生长性能：0.2%β-葡聚糖投喂30天提高生长参数，而0.1%β-葡聚糖在投喂40天后效果显著。

2. 0.2％β-葡聚糖能显著降低杀鲑气单胞菌感染后虹鳟的累积死亡率。

3. 虹鳟被感染后，0.1%和0.2%β-葡聚糖能降低指示性应激指标的活性，例如谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase，GOT）；同时，β-葡聚糖能提高某些功能性应激指标的浓度, 例如总蛋白（total protein，TP）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）。

4. β-葡聚糖能通过调节多种免疫因子和信号通路发挥功能：首先它能增加血液白细胞数量（white blood cells，WBC）、红细胞数量（red blood cells，RBC）和血红蛋白（hemoglobin，Hb）浓度。此外，它能提高血清免疫因子活性及其基因表达例如抗肿瘤坏死因子（anti-tumor necrosis factor，tnf-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，il-1β）和白细胞介素-8（interleukin-8，il-8）以及免疫球蛋白M（immunoglobulin m，igm）抵抗细菌感染。最后，β-葡聚糖能显著改变toll样受体（toll-like receptor，TLR）和细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号通路中关键基因的变化，包括toll样受体5（toll-like receptor 5，tlr5），补体3（complement 3，c3），髓样分化因子（myeloid differential protein-88，myd88）和主要组织相容性复合体II（major histocompatibility complex II，mhcii）。

5. 利用比较转录组分析细菌感染后β-葡聚糖参与的信号通路。KEGG通路分析显示，β-葡聚糖能调节补体信号通路、TLR信号通路、抗原加工和呈递，以及T细胞受体信号通路等免疫通路。此外，β-葡聚糖还参与调节某些代谢途径，包括血小板活化、凝血反应、脂肪消化和吸收等。

6. 本研究成功建立了TNBS诱导的虹鳟肠炎模型，并且发现0.2％β-葡聚糖能有效减弱肠炎。0.2％β-葡聚糖能降低鱼体的体重损失比、减弱肠道组织结构损伤、提高血清总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、氧化氢酶（catalase，CAT）、还原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和总抗氧化活力（total antioxidant capacity，T-AOC）在内的抗氧化剂活性，增加红细胞、白细胞数量和血红蛋白浓度，提高il-1β，il-6，tnf-α和il-8炎症基因表达。

第一章 绪论... 1

1.1 虹鳟的养殖和研究背景... 1

1.1.1 虹鳟的生物学特征... 1

1.1.2 虹鳟的养殖现状及研究进展... 2

1.2 鱼类养殖中的病害概况... 3

1.2.1 杀鲑气单胞菌的危害... 4

1.2.2 鱼类养殖中的肠炎现象... 5

1.2.3 病害防控措施... 7

1.3 免疫增强剂研究进展... 9

1.3.1 免疫增强剂的分类及作用原理... 10

1.3.2 β-葡聚糖的结构、种类及来源... 11

1.3.3 β-葡聚糖的作用途径... 13

1.4 转录组学在水产养殖中的应用... 15

1.4.1 选择性育种和资源保护... 15

1.4.2 免疫学... 16

1.4.3 应激生理学和毒理学... 16

1.5 本研究的目的、意义及内容... 16

第二章 β-葡聚糖对虹鳟生长及抗杀鲑气单胞菌感染的影响... 18

2.1 引言... 18

2.2 材料与方法... 19

2.2.1 β-葡聚糖饲料制作及养殖管理... 19

2.2.2 实验设计... 20

2.2.3 采样... 20

2.2.4 生长指标及死亡率... 21

2.2.5 血清生化指标测定... 21

2.2.6 RNA提取和反转录方法... 21

2.2.7 实时荧光定量方法... 22

2.2.8 数据分析... 23

2.3 结果... 23

2.3.1 β-葡聚糖对生长参数的调节... 23

2.3.2 累积死亡率... 24

2.3.3 抗氧化和免疫指标的变化... 25

2.4 讨论... 29

2.5 小结... 31

第三章 β-葡聚糖投喂对杀鲑气单胞菌感染的免疫因子和信号通路关键基因表达的影响    32

3.1 引言... 32

3.2 材料与方法... 32

3.2.1 β-葡聚糖饲料制作、养殖管理、采样... 32

3.2.2 血液指标分析... 32

3.2.3实时荧光定量实验... 33

3.2.4 数据统计分析... 34

3.3 结果... 34

3.3.1 血液生理指标... 34

3.3.2 免疫因子活性及mRNA表达... 36

3.3.3 通路关键基因表达... 38

3.4 讨论... 40

3.5 小节... 43

第四章 β-葡聚糖对杀鲑气单胞菌感染后虹鳟代谢指标的调节... 44

4.1 引言... 44

4.2 材料与方法... 44

4.2.1 实验材料... 44

4.2.2 血清生化指标检测... 45

4.2.3 数据分析... 45

4.3 结果... 45

4.3.1 血清酶活性... 45

4.3.2 血清代谢物含量... 47

4.4 讨论... 50

4.4.1 β-葡聚糖对血清酶的调节作用... 50

4.4.2 β-葡聚糖对血清代谢物的调节作用... 51

4.5 小结... 52

第五章 转录组揭示β-葡聚糖在虹鳟抗细菌感染中的保护机制... 55

5.1 引言... 55

5.2 材料与方法... 55

5.2.1 实验材料... 55

5.2.2 总RNA提取、建库和测序... 55

5.2.3 序列注释和差异基因表达分析... 56

5.2.4 转录本及通路注释... 56

5.2.5 qRT-PCR验证... 56

5.3 结果... 57

5.3.1 测序及序列比对... 57

5.3.2 差异表达基因分析... 59

5.3.3 差异表达基因聚类分析及GO富集分析... 61

5.3.4 差异表达基因KEGG通路富集分析... 63

5.3.5 β-葡聚糖调控免疫反应中的关键基因分析... 64

5.3.6 qRT-PCR验证转录组测序结果... 70

5.4 讨论... 71

5.4.1 差异表达基因模式分析... 71

5.4.2 β-葡聚糖调节免疫反应的关键基因... 71

5.4.3 β-葡聚糖调节代谢反应的关键基因... 72

5.5 小结... 73

第六章 β-葡聚糖对TNBS诱导的虹鳟肠炎的保护作用... 75

6.1 引言... 75

6.2 材料与方法... 76

6.2.1 β-葡聚糖饲料制作... 76

6.2.2 实验鱼养殖管理及实验设计... 76

6.2.3 生长指标测定... 77

6.2.4 肠炎诱导实验设计... 77

6.2.5 样品采集... 77

6.2.6 组织切片方法... 78

6.2.7 肠道病理学形态积分评估... 78

6.2.8 血液学指标测定... 78

6.2.9 实时荧光定量实验... 78

6.2.10 数据分析... 79

6.3 结果... 80

6.3.1 β-葡聚糖对生长的影响... 80

6.3.2 累积死亡率变化... 80

6.3.3 肠道组织形态学变化... 81

6.3.3 血液学指标的变化... 83

6.3.4 基因表达的变化... 86

6.4 讨论... 87

6.5 小结... 89

第七章 总结与展望... 90

7.1 结论... 90

7.2 展望... 91

参考文献... 93

致谢... 105

作者简历... 107

博士在读期间论文发表及撰写情况... 108